目的建立血液中乙醇含量的自動頂空-氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法(HS-GC-MS);考察靜脈血和心臟血中乙醇在不同保存條件下的穩(wěn)定性。通過研究靜脈采血消毒劑及消毒操作過程對血液中乙醇含量的影響,探討采血對樣本的可能污染來源及對血液中乙醇含量的影響。論文通過研究血液中乙醇含量的測定過程,分析采用HS-GC-MS法測定血液中乙醇含量的不確定度來源,給出采用該方法測定血液中乙醇含量的檢測結(jié)果的合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度和擴(kuò)展不確定度。本文建立了HS-GC-MS法測定血液中乙醇含量的質(zhì)控圖,為實(shí)驗(yàn)室開展日常酒駕檢測結(jié)果的質(zhì)量控制提供保障。方法(1)血液中乙醇含量的HS-GC-MS法測定：①樣品處理方法：準(zhǔn)確移取0.200mL標(biāo)準(zhǔn)溶液或者血液樣品于20mL頂空瓶中,加入0.100mg/mL的叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液0.800mL,立即用硅膠橡皮蓋密封。②自動頂空條件：對自動頂空的平衡時間和溫度進(jìn)行探討和選擇,確定爐溫：60℃,平衡時間：20min。傳輸線溫度100℃,進(jìn)樣傳輸線溫度90℃,進(jìn)樣間隔3min,樣本瓶加壓時間、定量環(huán)充滿時間和進(jìn)樣時間均為10s。③氣相色譜條件：選用Rxi-5MS, 30mx0.25mmx0.25μm色譜柱,載氣為氦氣,流速為1mL/min;進(jìn)樣口溫度為150℃,分流進(jìn)樣；柱溫：60℃,保持1.8min。④質(zhì)譜條件：離子源溫度和傳輸線溫度均為：250℃；電離方式為電子轟擊,電離能70eV。溶劑切除時間1.2min;選擇離子監(jiān)測模式(SIM)；間隔：O.1s。確定乙醇和叔丁醇的監(jiān)測離子分別為m/z=29、31、45、46和m/z=41、43、57、59。(2)血液中乙醇穩(wěn)定性研究：①實(shí)驗(yàn)對象：從送檢的乙醇檢測樣本中,選出普通塑料管盛裝的心臟血液樣本20例,正規(guī)采血管密封的靜脈血液樣本10例；用已建立的方法檢測其初始血液中乙醇的含量。②靜脈血液樣本實(shí)驗(yàn)過程：將靜脈血置于室溫(25℃)下,并于2h,24h,48h,72h分別檢測其血液中乙醇濃度；③心臟血液樣本實(shí)驗(yàn)過程：將20例樣本分別取3份密封于EP管中,每份0.75mL,第1份冷凍保存(-18℃),第2份冷藏保存(4℃),第3份室溫保存(25℃),并于2h,6h,12h,24h,168h(7天),336h(14天)和720h(30天)分別檢測其乙醇濃度。實(shí)驗(yàn)中每個樣本均做兩次平行測定,每批樣本測定時隨行制作一條標(biāo)準(zhǔn)曲線,每10個樣本后加一個標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制樣(濃度為0.800mg/mL)。采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行重復(fù)測量方差分析,先進(jìn)行Mauchly的球形度檢驗(yàn),若p0.001,則采用Huynh-Feldt調(diào)整后的F值和p值。(3)采血消毒對乙醇污染的分析：由于血液中乙醇的污染可能來源于采血時所用的消毒液,因此本實(shí)驗(yàn)采用Ⅱ型安爾碘(含65～75%乙醇)作為靜脈采血前皮膚消毒劑,以醋酸洗必泰(不含乙醇)作為對照進(jìn)行研究。①實(shí)驗(yàn)對象以及條件：30名志愿者隨機(jī)分為3組,每組男、女各5名。年齡在20～55歲之間,身體健康并對乙醇無過敏癥狀。所有志愿者在被采血前48小時內(nèi)均未飲酒。②實(shí)驗(yàn)過程：第1組志愿者右肘用Ⅱ型安爾碘清潔皮膚三次,未等消毒劑干燥立刻進(jìn)行靜脈穿刺采血；第2組右肘進(jìn)行同樣的消毒后,待消毒劑干燥30s后采血。第1、2組左肘均用醋酸洗必泰進(jìn)行相同的消毒和采血。第3組志愿者的左肘使用Ⅱ型安爾碘清潔皮膚三次,立刻進(jìn)行靜脈穿刺采血；右肘進(jìn)行同樣的消毒,干燥30s后采血。實(shí)驗(yàn)中第1、2組的受試對象全部采用干燥不含乙醇的棉簽按壓傷口后拔針,第3組則采用安爾碘完全浸潤的棉簽按壓傷口后拔針。實(shí)驗(yàn)中采用一次性針頭穿刺采血2mL,直接收集于K2EDTA干燥真空抗凝采血管,混勻,用所建立的方法檢測。(4)血液中乙醇含量不確定度評定：依據(jù)不確定度評定的指導(dǎo)性文件,從分析測量過程入手,詳細(xì)研究測量方法、測量系統(tǒng)和測量程序,根據(jù)檢測操作流程和結(jié)果的計(jì)算公式構(gòu)建乙醇含量測定不確定度的因果關(guān)系結(jié)構(gòu)圖,畫出測量方法的測量流程圖,并分別計(jì)算相應(yīng)的不確定度。①制樣及分析：取一支陽性血液樣本,移取0.20mL乙醇標(biāo)準(zhǔn)液或血樣于20mL頂空瓶中,加入0.100mg/mL叔丁醇內(nèi)標(biāo)溶液0.80mL,封瓶,用已建立的方法進(jìn)行分析,測得其乙醇濃度。②A類不確定度的評定方法：在同一條件下對濃度為0.80mg/mL的質(zhì)量控制樣品重復(fù)測量40次,用統(tǒng)計(jì)分析方法獲得40份檢測結(jié)果平均值x、殘差平方和v2,實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差S(Xk)以及A類不確定度；③B類不確定度的評定方法：根據(jù)有關(guān)的信息或經(jīng)驗(yàn),判斷被測量的可能值區(qū)間(；-a,x+a),依照概率分布和要求的概率P確定κ。分析得到本實(shí)驗(yàn)中B類不確定度來源有：乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和叔丁醇引入的相對不確定度,移液器和GC/MS引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度,標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對不確定度以及峰面積和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境引入的不確定度。則B類評定的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(x)可由公式u(x)=a/k計(jì)算；④合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的評定方法：由各輸入量的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度獲得的輸出量的標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度。由于乙醇濃度測定過程中各個輸入量之間均不相關(guān),因此合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度的計(jì)算公式為：⑤擴(kuò)展不確定度的評定方法：擴(kuò)展不確定度U由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc乘包含因子k得到,按公式：U=kuc計(jì)算。(5)質(zhì)量控制圖的繪制：記錄實(shí)驗(yàn)中每次隨行測量的濃度為0.80mg/mL的乙醇標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制樣品100次,計(jì)算平均值(x)以及標(biāo)準(zhǔn)差(s),求得上、下控制線——UCL.LCL(x±3s),上、下警告線-UWL、LWL(x±2s)以及上、下輔助線—UAL、LAL (x±s)值。平均值(x)用來界定分布的中心,標(biāo)準(zhǔn)差(s)表明數(shù)據(jù)的展開情況。以測定順序?yàn)闄M坐標(biāo)x軸；測定結(jié)果為縱坐標(biāo)y軸；預(yù)期值(即平均值)為中心線；±3s為控制限,表示測定結(jié)果的可接受范圍；±2s為警告限,表示測定結(jié)果目標(biāo)值區(qū)域；±s為檢查測定結(jié)果質(zhì)量的輔助指標(biāo)所在區(qū)間,繪制出本實(shí)驗(yàn)的質(zhì)量控制圖。計(jì)算出上、下輔助線之間的點(diǎn)數(shù)占總點(diǎn)數(shù)的百分比,檢驗(yàn)該質(zhì)控圖是否適用。最后用同條件測定的20次質(zhì)控樣品對質(zhì)量分析進(jìn)行評定,看質(zhì)控樣是否落在上、下警告限之內(nèi),判斷乙醇測定結(jié)果是否可信。結(jié)果(1)建立了自動頂空-氣相色譜-質(zhì)譜檢測血液中乙醇含量的方法,通過優(yōu)化方法后,選定頂空的平衡溫度和平衡時間分別是60℃和20min,乙醇和叔丁醇的定量離子分別45和59,乙醇和叔丁醇的出峰時間分別為1.47min和1.56min。以乙醇濃度(x)對乙醇和叔丁醇定量離子的峰面積比值(y)作標(biāo)準(zhǔn)曲線,濃度范圍在0.01～10.00mg/mL的線性回歸方程為y=0.28865x-0.00304,相關(guān)系數(shù)r為0.9998。檢出限(3S/N)為0.0006 mg/mL,定量檢測限(10S/N)為0.002 mg/mL。乙醇的回收率為99%-112%,方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(n=6)小于5%。(2)血液中乙醇穩(wěn)定性結(jié)果：①靜脈血液在室溫(25℃)下放置24、48和72h,在48h之前乙醇濃度沒有明顯變化,表明樣品在本實(shí)驗(yàn)室的室溫條件下至少兩天內(nèi)(48h)是穩(wěn)定的。②在冷凍(-18℃)條件下,心臟血中乙醇在30天內(nèi)穩(wěn)定(p0.05)；冷藏(4℃)保存時7天內(nèi)心臟血中的乙醇是穩(wěn)定的(p0.05),在第14天以后至30天乙醇濃度略有減少(p0.001)。心臟血中的乙醇在室溫下(25℃)2h內(nèi)是穩(wěn)定的(p=0.717),在6h至24h,心臟血中乙醇濃度出現(xiàn)明顯增加(p0.001),在24h以后乙醇濃度下降。(3)采血消毒對乙醇污染：使用干燥棉簽按壓方式拔針時,無論消毒劑是否含有乙醇、皮膚上的消毒劑是否干燥,血液樣本均未檢測出乙醇。使用經(jīng)安爾碘溶液(含乙醇)浸潤的棉簽按壓傷口進(jìn)行拔針時,10個樣本有4個以上被乙醇污染,檢出乙醇的濃度為0.0030-0.0270mg/mL。(4)血液中乙醇含量不確定度評定：本實(shí)驗(yàn)室采用HS-GC-MS法對血液中乙醇含量的測定,血液中乙醇含量的不確定度主要由樣品檢測、乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線引入,而檢測儀器、內(nèi)標(biāo)帶、樣品等帶來的不確定度很小,可忽略不計(jì)。血液中的乙醇濃度平均值為0.738mg/mL時,根據(jù)本文不確定度的計(jì)算方法其合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.040mg/mL,擴(kuò)展不確定度為0.080mg/mL(κ=2)。(5)質(zhì)量控制圖的繪制：濃度為0.80mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制樣品的100次質(zhì)控結(jié)果的X=0.804 mg/mL, s= 0.045,UCL=0.938mg/mL、CL=0.669 mg/mL; UWL=0.894 mg/mL、LWL=0.714 mg/mL 和 UAL=0.849 mg/mL、LAL=0.759 mg/mL。100次質(zhì)控結(jié)果分布在上、下輔助線之間的點(diǎn)數(shù)占總點(diǎn)數(shù)的72%。用所得質(zhì)控圖檢驗(yàn)10次質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制樣品,測定值均落在上、下警告限之內(nèi)。,分析結(jié)果質(zhì)量正常,試樣測定結(jié)果可靠。結(jié)論：(1)本文所建立的自動頂空-氣相色譜-質(zhì)譜檢測方法充分利用了色譜的分離和質(zhì)譜的定性功能,可對樣品中乙醇的含量進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定量定性分析。能夠滿足司法和臨床血液中乙醇含量分析；(2)在對影響血液中乙醇含量測定的影響因素進(jìn)行探討中發(fā)現(xiàn),靜脈血液樣本的存放在室溫下不超過2天,心臟血在室溫下放置不超過2小時,這樣才可以保證結(jié)果的真實(shí)有效；(3)在國內(nèi)的臨床采血規(guī)范中,只要求是經(jīng)過消毒的棉簽,所以使用干燥(不含乙醇)或者經(jīng)由消毒劑浸潤(含乙醇)的棉簽按壓傷口都是合乎臨床規(guī)范的。研究表明采血時皮膚消毒對血液中乙醇含量沒有影響；(4)全文通過對臨界值不確定度進(jìn)行分析和制作質(zhì)量控制圖,很好的對檢測結(jié)果進(jìn)行了質(zhì)量控制,為準(zhǔn)確可靠的分析測定血液中乙醇含量提供依據(jù)。



本文編號：2089230