發(fā)布時間：2018-05-18 15:22

  本文選題：銅綠假單胞菌 + MNPs　； 參考：《東南大學》2015年博士論文

【摘要】：銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)是一種投機主義的革蘭氏陰性菌,易在免疫力低下個體中盛行,因此在醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染病例中許多是由P. aeruginosa引起的。P. aeruginosa是目前各種醫(yī)院內(nèi)感染中最廣泛、最嚴重的問題之一,感染率居病原菌之首。由于P. aeruginosa在濃度很低的時候就能引起感染,因此早期檢測對于治療P. aeruginosa引起的感染至關重要。納米技術在過去二十年取得了飛速的發(fā)展,由于其具有高表面積以及容易被外部磁場控制等特點,已經(jīng)為快速自動化生物分子檢測開啟了一扇新的大門。本研究擬利用磁性納米技術建立易于實現(xiàn)自動化的P. aeruginosa高靈敏檢測及分型方法。具體研究內(nèi)容如下。1、超分散性磁性納米粒子(MNPs)的制備及表面修飾由于MNPs在眾多領域的廣泛應用,合成不同類型的MNPs一直是研究的熱點。我們以PEG-4000為表面活性劑,通過高溫溶劑熱法制備了一種高分散性的MNPs。研究結(jié)果表明,在最佳條件下合成的MNPs粒徑在350-450 nm之問,具有良好的分散性和非常窄的粒徑分布。沉降實驗顯示,合成的MNPs與商品化MNPs MP10101相比沉降時間大大增長,12小時后仍保持良好的分散性。為了獲得更加穩(wěn)定的功能化粒子,我們在MNPs表面進行了層層修飾,SEM、TEM及FTIR等分析表征手段證明得到的功能化MNPs具有良好的分散性及均一的形貌。元素分析及能量圖譜結(jié)果顯示MNPs@Probe表面P元素含量為0.33%。2、建立了基于磁富集PCR及磁富集巢式PCR的P. aeruginosa高靈敏檢測方法P. aeruginosa是一種臨床上常見的條件致病菌,也是威脅人類健康的主要因素之一。由于核酸自動化檢測發(fā)展的必然趨勢,近幾年來基于MNPs的基因組DNA分離和檢測技術得到了快速發(fā)展。本論文以P. aeruginosa特異性基因gyrB為研究對象,優(yōu)化并建立了一種磁富集PCR方法。在相同菌液濃度的條件下,磁富集PCR與傳統(tǒng)PCR相比因具有更高的模板利用率,所以擴增效率更高。構(gòu)建的檢測方法可以有效地檢測到100 cfu/mL的P. aeruginosa。在磁富集PCR的基礎上,進一步發(fā)展了ecfX基因的磁富集巢式PCR,建立了高特異性、高靈敏度的檢測方法。實驗結(jié)果表明該方法有良好的特異性和靈敏度,P. aeruginosa的最低檢出濃度為10cfu/mLo該方法不僅為P. aeruginosa高靈敏早期檢測提供了技術基礎,也縮短了從核酸抽提到樣本檢測的時間和簡化了操作步驟,為實現(xiàn)快速自動化檢測提供了新的思路。3、利用磁富集PCR、磁分離技術及化學發(fā)光技術構(gòu)建了P. aeruginosa的超靈敏檢測方法盡管磁富集巢式PCR方法可以實現(xiàn)P. aeruginosa高靈敏檢測,但是由于其難以實現(xiàn)自動化及定量檢測,在臨床檢驗受到了諸多限制。為此,基于磁富集PCR、磁分離及化學發(fā)光技術,建立了一種P. aeruginosa易于實現(xiàn)自動化的超靈敏定量檢測方法,并對該方法進行了條件優(yōu)化。我們用該方法檢測了3株P. aeruginosa標準菌株(ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104)。結(jié)果顯示,樣本的化學發(fā)光強度與對照相比均具有顯著性差異且Q值大于2.1。靈敏度研究結(jié)果顯示,該方法能檢測到30 fM的PCR產(chǎn)物及10 cfu/mL的樣本。該方法對大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、痢疾志賀氏菌及金黃色葡萄球菌樣本檢測結(jié)果均為陰性,表明具有較高的特異性。4、建立了基于磁富集多重PCR及化學發(fā)光的P. aeruginosa T3SS基因分型方法本研究利用磁富集多重PCR和化學發(fā)光技術建立了一種T3SS基因的快速分型方法。我們使用該方法對三個P. aeruginosa標準菌株ATCC27853、ATCC9027及CMCC10104進行了分型驗證。結(jié)果表明,這三個菌株的T3SS基因中,exoT、exoY、exoS三個基因化學發(fā)光值都大于對照10倍以上,Q值也均大于2.1,三個標準株exoU的Q值均少于2.1。檢測結(jié)果與電泳結(jié)果相符合,說明建立的方法是可靠的。利用該方法對22株臨床樣本進行了T3SS基因型的研究。結(jié)果表明,在22個臨床樣本中,100%的樣本中含有exoT基因,72.7%的樣本含有exoY基因,95.5%的樣本含有exoS基因,4.5%的樣本含有exoU基因,exoS與exoU基因不能同時存在于同一菌株中。臨床樣本分型的所有結(jié)果均與PCR分型結(jié)果一致。5、結(jié)合磁富集及磁分離雙色熒光雜交技術建立了exoS基因SNP分型方法P. aeruginosa T3SS的exoU、exoS、exoT及exoY四個毒力基因都含有SNP位點。前面研究顯示22個臨床樣本中95.5%含有exoS。結(jié)合磁富集PCR、磁分離及雙色熒光雜交技術,建立了exoS基因G162A及G434C位點SNP分型方法,為了解P. aeruginosa T3SS基因型的變異提供了技術基礎。利用這個方法對三株標準菌株分別進行了這兩個位點的SNP分型研究。結(jié)果表明三個標準菌株的兩個SNP位點G值均大于0.8,且Ⅰ值均大于3。根據(jù)分型標準分型,所有樣本的SNP位點都是野生型的,且具有統(tǒng)計學意義。用該方法對21株含exoS的臨床樣本進行了G162A和G434C位點SNP分型。結(jié)果表明在21個臨床樣本的G162A位點分型中,57.1%為野生型,23.8%為突變型,9.5%為雜合型。在21個臨床樣本的G434C位點分型中,80.9%為野生型,14.3%為突變型,4.8%為雜合型。
[Abstract]:P . aeruginosa ( P . aeruginosa ) is a kind of opportunistic Gram - negative bacteria , which is easy to be used in low - immunity individuals . P . aeruginosa is one of the most widely used and most serious problems in hospital and community - acquired infections . Pseudomonas aeruginosa was highly sensitive . However , because of its difficult realization of automation and quantitative detection , a kind of highly sensitive quantitative detection method for P . aeruginosa was established on the basis of magnetic enrichment PCR , magnetic separation and chemiluminescence . The method was optimized . Three strains of P . aeruginosa were tested by this method ( ATCC 27853 , ATCC 9027 and CMCC10104 ) . The results showed that the results showed that exotoxin , exoS , exogenes and exogenes of three strains of P . aeruginosa could not simultaneously exist in the same strain .
【學位授予單位】：東南大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R440
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本文編號：1906352