本文關(guān)鍵詞：馬爾尼菲青霉氟康唑耐藥機(jī)制的研究　出處：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的氟康唑(Fluconazole, FLC)是我國臨床上治療馬爾尼菲青霉(Penicillium marneffei, PM)感染的常用抗真菌藥物,但臨床療效欠佳,體外藥敏示MIC值較高,考慮部分PM存在FLC耐藥的可能。本研究擬探討PM FLC耐藥與唑類藥物靶酶基因及藥物流出泵基因表達(dá)和功能的關(guān)系,了解PM對FLC不敏感的分子機(jī)制。方法 實(shí)驗(yàn)菌株包括2株FLC臨床治療抵抗、體外藥敏提示FLC MIC較高的PM臨床耐藥株A1、A3；以PM標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161為母本,通過在含F(xiàn)LC濃度≥64μg/ml培養(yǎng)基上誘導(dǎo)獲得的6株P(guān)M誘導(dǎo)株C2、C3、C4、B3、B4、B5；以及標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161。在此基礎(chǔ)上,課題組進(jìn)行了以下研究：(1)參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(clinical and laboratory standard institute, CLSI)的M38-A2方案并作適當(dāng)修改,采用微量稀釋法測定實(shí)驗(yàn)菌株對兩性霉素B (amphotericin B, AmB)、FLC、伊曲康唑(itraconazole,ITC)、伏立康唑(voriconazole, VOC)敏感性,并借鑒白念珠菌FLC藥敏判斷標(biāo)準(zhǔn)建立PM FLC藥敏標(biāo)準(zhǔn)；(2)在25℃時FLC耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株進(jìn)行比較,觀察實(shí)驗(yàn)菌株的表型特征、生長速率及產(chǎn)孢率；(3)做銅圈小培養(yǎng),觀察25℃時實(shí)驗(yàn)菌株的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)；(4)提取標(biāo)準(zhǔn)株及FLC耐藥株的DNA,測定實(shí)驗(yàn)菌株的ITS (Internal Transcribed Spacer)區(qū)序列,進(jìn)行比對；(5)對實(shí)驗(yàn)菌株用4種隨機(jī)引物P23、P103、P105、P120進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性分析(Randomly amplified polymorphic DNA, RAPD);(6)對實(shí)驗(yàn)菌株的唑類藥物靶酶基因cyp51B進(jìn)行測序,并與GenBank中公布的PM基因cyp51B序列進(jìn)行比對；(7)提取實(shí)驗(yàn)菌株的RNA,用real time PCR分別測定各菌株中唑類藥物靶酶基因cyp51B及相關(guān)藥物流出泵基因的相對表達(dá)量。(8)所得數(shù)據(jù)通過軟件SPSS16.0采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較,P0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果 (1)建立PMFLC藥敏標(biāo)準(zhǔn)：選取FLC MIC值2.0～8.0μg/ml敏感,16～32μg/ml劑量依賴性敏感,大于或等于64μg/ml判斷為耐藥。實(shí)驗(yàn)菌株除標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161外,余菌株FLC MIC值范圍為128～256μg/ml,符合FLC耐藥判斷標(biāo)準(zhǔn)；實(shí)驗(yàn)菌株均對AmB、ITC以及VOC敏感；(2)25℃時PM FLC耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161相比,生長速率下降(P0.05)；(3)25℃銅圈小培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)示PM FLC耐藥株產(chǎn)分生孢子數(shù)相對標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161降低；(4) PM FLC耐藥株和標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161與GenBank上公布的PM ITS區(qū)序列完全一致；(5) RAPD實(shí)驗(yàn)中,PM FLC誘導(dǎo)耐藥株與其母本標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161比較,用4種隨機(jī)引物進(jìn)行擴(kuò)增,所得產(chǎn)物帶型完全一致,但其帶型與PM FLC I臨床耐藥株明顯不同；(6)實(shí)驗(yàn)菌株存在藥物靶酶基因cyp51B不同堿基位點(diǎn)的突變,而造成相應(yīng)氨基酸的替換：菌株C2、C4的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1583C的點(diǎn)突變,導(dǎo)致14α脫甲基酶第440位的絡(luò)氨酸被組氨酸替代(Y440H)；菌株B4、B5的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有G1587T的點(diǎn)突變,導(dǎo)致14α脫甲基酶第441位的甘氨酸被纈氨酸替代(G441V)；菌株A1的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有T1618C的點(diǎn)突變,但14α脫甲基酶沒有氨基酸的替換；菌株A3的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)有G1587A、T1618C的點(diǎn)突變,導(dǎo)致14a脫甲基酶第441位的甘氨酸被天冬氨酸替代(G441D)；菌株C3、B3的靶酶基因cyp51B編碼區(qū)未見點(diǎn)突變。(7)PMFLC耐藥株與標(biāo)準(zhǔn)株FRR2161比較,藥物排出泵基因AtrF、Mdr1、 PMFCZ表達(dá)量增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而靶酶基因cyp51B、藥物排出泵基因ABC和MFS表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論體外誘導(dǎo)PMFLC耐藥株成功,并且該FLC耐藥特性可穩(wěn)定傳代；唑類藥物靶酶基因cyp51B的點(diǎn)突變可能是PM出現(xiàn)FLC耐藥現(xiàn)象的主要原因；部分藥物排出泵基因表達(dá)水平的上升可能也參與到了FLC耐藥機(jī)制中。
[Abstract]:In this study , we studied the relationship between the drug resistance and the expression and function of the drug efflux pump . 瑙傚療25鈩冩椂瀹為獙鑿屾牚鐨勪駭瀛㈢粨鏋勶紱(4)鎻愬彇鏍囧噯鏍強(qiáng)FLC鑰愯嵂鏍殑DNA,嫻嬪畾瀹為獙鑿屾牚鐨処TS (Internal Transcribed Spacer)鍖哄簭鍒，

本文編號：1417551