本文關(guān)鍵詞：斑馬魚活性Tc1轉(zhuǎn)座子的挖掘及驗證

  更多相關(guān)文章： 轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)座活性 斑馬魚 小鼠 基因治療

【摘要】：轉(zhuǎn)座子廣泛分布于細(xì)菌、真菌及昆蟲等各種生物中,是一種可以在基因組內(nèi)移動的DNA元件,在轉(zhuǎn)基因和基因治療等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。目前國際上轉(zhuǎn)座子的研發(fā)和應(yīng)用研究取得顯著進展,女PB、SB、Tol2等轉(zhuǎn)座子已經(jīng)作為基因治療和轉(zhuǎn)基因的介導(dǎo)載體得到廣泛應(yīng)用,但國內(nèi)自主知識產(chǎn)權(quán)的轉(zhuǎn)座子研發(fā)相對滯后。本研究通過斑馬魚基因組上DNA轉(zhuǎn)座子挖掘,并經(jīng)過脊椎動物細(xì)胞和胚胎水平驗證,獲得高活性ZB轉(zhuǎn)座子,為動物轉(zhuǎn)基因、功能基因組學(xué)(基因捕獲等)和基因治療等研究提供具有自主知識產(chǎn)權(quán)的遺傳操作工具。主要研究內(nèi)容如下：(1)通過生物信息學(xué)分析,在斑馬魚基因組中發(fā)現(xiàn)5個結(jié)構(gòu)完整的Tc1/Mariner家族DNA轉(zhuǎn)座子。遺傳分化比較表明,其中1個轉(zhuǎn)座子活性最強,是年輕轉(zhuǎn)座子,命名為ZB。完整ZB轉(zhuǎn)座子全長1.4kb,兩端各有一個對稱的203bp的末端反向重復(fù)序列,中間含有1026bp的轉(zhuǎn)座酶基因編碼序列。斑馬魚基因組中至少存在21個ZB拷貝,其中16個為完整的拷貝,DNA序列和ORF的氨基酸序列的同源性分別為99.80%和99.47%。ZB兩端的TIR序列相似性達(dá)100%。其ORF含有Tcl轉(zhuǎn)座子典型的保守結(jié)構(gòu)域(如HTH、NLS、DD34E等)。(2)經(jīng)過qPCR和原位雜交檢測表明,ZB轉(zhuǎn)座酶的正反轉(zhuǎn)錄子在斑馬魚在所檢測的11階段都有表達(dá),且表達(dá)強度隨著時間的增加而升高。在成年斑馬魚大腦、心臟、肌肉、睪丸和卵巢組織中表達(dá)存在差異,且在大腦中表達(dá)量最高,在心臟、睪丸和卵巢組織較低。(3)為驗證ZB在哺乳動物細(xì)胞上的活性,克隆ZB轉(zhuǎn)座子的上下游TIR轉(zhuǎn)座元件和轉(zhuǎn)座酶ORF,分別構(gòu)建成框架載體pZB-Msc和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒(pCMV-ZB)。再將含有新霉素性基因表達(dá)盒(PGK-NEO)克隆至轉(zhuǎn)座子框架載體pZB-Msc,形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒pZB-PGK-NEO,然后將轉(zhuǎn)座子(pZB-PGK-NEO)和轉(zhuǎn)座酶以不同質(zhì)量比共轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞,并與PB、SB和To12轉(zhuǎn)座子進行比較。試驗結(jié)果表明4種轉(zhuǎn)座子實驗組表達(dá)新霉素抗性基因的細(xì)胞數(shù)量均高于對照組,且ZB轉(zhuǎn)座子體統(tǒng)在1：1質(zhì)量比時含抗性的細(xì)胞數(shù)量最多,即轉(zhuǎn)座效率最高。ZB在10：1,2：1,1：1,1：2質(zhì)量比時,抗性細(xì)胞數(shù)量高于SB轉(zhuǎn)座子,且在1：1時差異明顯(P0.01)。ZB的轉(zhuǎn)座效率可以與PB媲美,高于SB和TOL2(P0.05)。(4)為驗證ZB在斑馬魚胚胎上的轉(zhuǎn)座活性,將含有鯉魚beta-actin啟動子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)盒(FAG-GFP)分別克隆至轉(zhuǎn)座子框架載體pZB-Msc,形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒,然后將轉(zhuǎn)座子(含F(xiàn)AG-GFP表達(dá)盒)和轉(zhuǎn)座酶mRNA共注射斑馬魚一細(xì)胞期胚胎,注射后觀察熒光,比較4種轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座效率,試驗結(jié)果表明,在注射后24hpf和5dpf的GFP陽性率ZB轉(zhuǎn)座子均高于其它3種轉(zhuǎn)座子,且顯著高于SB轉(zhuǎn)座子(P0.05)。(5)為驗證ZB在小鼠胚胎上的轉(zhuǎn)座活性,將含有雞beta-actin啟動子和GFP基因的綠色熒光蛋白表達(dá)盒(CAG-GFP)克隆至轉(zhuǎn)座子框架載體pZB-Msc,形成轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒,然后將轉(zhuǎn)座子(含CAG-GFP表達(dá)盒)和轉(zhuǎn)座酶共注射小鼠受精卵,注射后胚胎發(fā)育至囊胚期觀察熒光,每組重復(fù)三次,試驗結(jié)果顯示3組胚胎均有熒光,加轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)座酶mRNA組和未加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率分別為31.76%(n=110)、33.43%(n=147)和4.34%(n=162),加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率均顯著高于未加轉(zhuǎn)座酶組(P0.05),加轉(zhuǎn)座酶組的胚胎陽性率之間差異不顯著(P0.05)。本研究表明,新發(fā)現(xiàn)的ZB轉(zhuǎn)座子是高活性轉(zhuǎn)座子,該轉(zhuǎn)座子能夠在哺乳動物細(xì)胞、小鼠胚胎和斑馬魚胚胎上高效介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)移,在轉(zhuǎn)基因動物制備和基因治療中具有較好的應(yīng)用前景。
【關(guān)鍵詞】：轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)基因 轉(zhuǎn)座活性 斑馬魚 小鼠 基因治療
【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：Q78
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-11
• 英文縮略詞11-12
• 前言12-13
• 第一篇 文獻綜述 Tc1/Mariner超家族的研究進展13-26
• 1 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)14-15
• 2 Tc1/Mariner的轉(zhuǎn)座機制15-16
• 3 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族的分類及分布16-18
• 4 活性Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子的挖掘及活性驗證18-20
• 5 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子應(yīng)用研究現(xiàn)狀20-26
• 5.1 轉(zhuǎn)基因21-22
• 5.2 基因捕獲22-25
• 5.3 基因治療25-26
• 第二篇 試驗研究26-64
• 第一章 斑馬魚Tc1轉(zhuǎn)座子家族生物信息學(xué)分析26-35
• 1 材料與方法26-27
• 1.1 Tc1轉(zhuǎn)座子的挖掘26-27
• 1.2 進化樹構(gòu)建27
• 1.3 系統(tǒng)發(fā)育分析27
• 2 結(jié)果27-34
• 2.1 斑馬魚Tc1成員及構(gòu)成27-29
• 2.2 斑馬魚Tc1轉(zhuǎn)座子活性比較29-30
• 2.3 斑馬魚Tc1-c轉(zhuǎn)座子活性預(yù)測30-34
• 3 討論34-35
• 第二章 斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座子的時空表達(dá)特性35-45
• 1 材料與方法35-40
• 1.1 實驗材料35-36
• 1.2 實驗方法36-40
• 2 結(jié)果40-44
• 2.1 斑馬魚ZB轉(zhuǎn)座酶mRNA的時空表達(dá)譜40-41
• 2.2 斑馬魚早期胚胎中表達(dá)ZB轉(zhuǎn)座酶RNA原位雜交結(jié)果41-44
• 3 討論44-45
• 第三章 細(xì)胞水平活性驗證45-55
• 1 材料與方法45-49
• 1.1 菌株及試劑45
• 1.2 載體構(gòu)建所用引物的設(shè)計與合成45-46
• 1.3 轉(zhuǎn)座子供體pZB-Msc的構(gòu)建46-47
• 1.4 轉(zhuǎn)座酶表達(dá)載體pCMV-ZB的構(gòu)建47-48
• 1.5 pZB-PGK-NEO載體構(gòu)建48
• 1.6 細(xì)胞水平驗證(Hela)ZB轉(zhuǎn)座活性48-49
• 2 結(jié)果49-54
• 2.1 ZB轉(zhuǎn)座元件的克隆與鑒定49-50
• 2.2 pZB-Msc載體的構(gòu)建與鑒定50
• 2.3 ZB轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定50-51
• 2.4 PGK-NEO-bGHpA的克隆及鑒定51-52
• 2.5 細(xì)胞水平驗證ZB轉(zhuǎn)座活性52-54
• 3 討論54-55
• 第四章 胚胎水平活性驗證55-64
• 1 材料與方法55-58
• 1.1 菌株及試劑55
• 1.2 轉(zhuǎn)座酶體外轉(zhuǎn)錄輔助質(zhì)粒pTNT-ZB的構(gòu)建55-56
• 1.3 轉(zhuǎn)座子載體pZB-CAG-GFP的構(gòu)建56
• 1.4 轉(zhuǎn)座子載體pZB-FAG-GFP的構(gòu)建56-57
• 1.5 體外轉(zhuǎn)錄制備轉(zhuǎn)座酶mRNA57
• 1.6 斑馬魚胚胎水平驗證ZB轉(zhuǎn)座活性57-58
• 1.7 小鼠胚胎水平驗證ZB轉(zhuǎn)座活性58
• 2 結(jié)果58-62
• 2.1 pTNT-ZB載體的構(gòu)建與鑒定58-59
• 2.2 pZB-CAG-GFP載體的構(gòu)建與鑒定59
• 2.3 pZB-FAG-GFP載體的構(gòu)建與鑒定59-60
• 2.4 ZB-mRNA制備與鑒定60
• 2.5 斑馬魚胚胎水平驗證ZB轉(zhuǎn)座活性60-62
• 2.6 小鼠胚胎水平驗證ZB轉(zhuǎn)座活性62
• 3 討論62-64
• 全文結(jié)論64-65
• 參考文獻(References)65-73
• 致謝73-74
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文74-75

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