本文關(guān)鍵詞：羊種布魯氏菌015株gmd、per和manb缺失株的構(gòu)建及診斷抗原反應原性評價研究

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【摘要】：布魯氏菌病是一種人畜共患疾病,對畜牧業(yè)和人類健康構(gòu)成了巨大威脅,被列為B類傳染病。目前還沒有人用布病疫苗,主要是通過布魯氏菌弱毒活疫苗接種動物來防控布病。目前大多數(shù)動物布病疫苗為光滑型的減毒活疫苗,毒副作用較大、無法區(qū)分自然感染和人工免疫等不足。布魯氏菌的致病機制還不完全清楚。脂多糖(LPS)是布氏桿菌非常重要的毒力因子,具有較強的抗原性。根據(jù)現(xiàn)有的研究表明,LPS的完整性與其胞內(nèi)存活、增殖和毒力等密切相關(guān)。gmd、per和manb都與光滑型布魯氏菌的LPS的生物合成過程有關(guān)。這些基因的缺失可以導致光滑型布魯氏菌變?yōu)榇植谛筒剪斒暇Ｄ康?本研究通過同源重組缺失了羊種布魯氏菌生物3型流行株015的gmd,per和manb基因,構(gòu)建相應的粗糙型缺失株;并在小鼠巨噬細胞RAW264.7和昆明系小鼠體內(nèi)初步評價其毒力致弱情況,檢測了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平;同時分別表達了gmd,per和manb蛋白,Western blot驗證其反應原性;旨在為研發(fā)能區(qū)分疫苗免疫和自然感染的羊種布魯氏菌標記性疫苗提供基礎(chǔ)材料。方法:本研究以羊種布魯氏菌015為模板,分別克隆gmd,per和manb基因的上、下游同源臂,以枯草芽孢桿菌為模板克隆SacB基因,將克隆得到的序列連接到pMDS19-T載體上,采用雙酶切法將上游同源臂、下游同源臂、SacB序列分別連到自殺載體pGEM-7Zf上,分別構(gòu)建了同源重組自殺載體pGEM-7Zf-Δgmd-SacB(pgs),pGEM-7Zf-Δper SacB(pps)和pGEM-7Zf-Δmanb-SacB(pms),然后分別電轉(zhuǎn)至羊種布魯氏菌015感受態(tài)細胞中,通過多次篩選分別獲得015Δgmd,015Δper和015Δmanb基因缺失株;對獲得的缺失株進行PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性等檢測。用穩(wěn)定遺傳的粗糙型缺失株分別侵染鼠源巨噬細胞RAW264.7和昆明系小鼠,通過載菌量(CFU)檢測缺失株毒力致弱情況;通過間接ELISA方法檢測了免疫小鼠血清中IgG和IFN-γ水平。此外,用PCR方法分別擴增gmd,per和manb基因,將測序正確的基因序列分別克隆到大腸桿菌表達載體pET-28a上,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3(BL21)中誘導表達。建立穩(wěn)定的表達gmd,per和manb蛋白的體系,用布魯氏菌自然感染綿羊血清進行western blot檢測,最終篩選出有鑒別診斷意義的抗原蛋白。結(jié)果:成功構(gòu)建了遺傳穩(wěn)定的粗糙型羊種布魯氏菌015Δgmd,015Δper,015Δmanb缺失株,在20代內(nèi)沒有發(fā)生回復突變;015Δgmd,015Δper和015Δmanb缺失株在細胞水平和小鼠體體內(nèi)證實毒力都顯著降低且具有較好的免疫原性;以布魯氏菌自然感染羊血清證實gmd、manb和per蛋白反應原性良好,具有自然感染與候選疫苗免疫抗體區(qū)分的潛在價值。結(jié)論:構(gòu)建的羊種布魯氏菌015Δgmd、015Δper和015Δper缺失株與對應表達蛋白聯(lián)合應用,有望研發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的缺失候選疫苗及配套診斷方法。
【關(guān)鍵詞】：布魯氏菌 manb基因 per基因 gmd基因 同源重組 脂多糖 鑒別診斷
【學位授予單位】：石河子大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：S855.12
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-14
• 英文及字符縮略詞表14-15
• 引言15-17
• 第一章 文獻綜述 布魯氏菌概述17-35
• 1 布魯氏菌的病原學特征17-19
• 1.1 布魯氏菌分類17-18
• 1.2 形態(tài)及染色特性18
• 1.3 培養(yǎng)及抵抗力18-19
• 1.4 致病性19
• 2 布病疫情情況19-23
• 2.1 世界布病流行情況19-20
• 2.2 我國布病流行情況20
• 2.3 新疆布病流行情況20-21
• 2.4 布魯氏菌病的防制21-22
• 2.5 魯氏菌病根除計劃22-23
• 3 布魯氏菌病的診斷方法23-25
• 3.1 細菌培養(yǎng)法23
• 3.2 血清學技術(shù)23-24
• 3.2.1 凝集反應23-24
• 3.2.2 補體結(jié)合試驗(CFT)24
• 3.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)24
• 3.3 聚合酶鏈反應(PCR)在布病檢測中的應用24-25
• 3.3.1 PCR應用于布魯氏菌抗原鑒定的研究24-25
• 3.3.2 PCR應用于布魯氏菌種型的鑒定研究25
• 4 布魯氏菌主要的毒力因子25-29
• 4.1 脂多糖及合成相關(guān)的毒力基因（manb、per和gmd）25-27
• 4.2 BvrR/BvrS雙組分系統(tǒng)27
• 4.3 四型分泌系統(tǒng)(Type 4 secretion system,T4SS）27-28
• 4.4 密度感應系統(tǒng)(Quorum Sensing ,QS)28
• 4.5 其他毒力因子28-29
• 4.5.1 外膜蛋白(Major outer membrane proteins,OMPs )28
• 4.5.2 環(huán)β-1,2 葡聚糖(Cyclicβ-1,2-glucans,CβGs)28-29
• 4.5.3 應激反應蛋白29
• 5 布魯氏菌病疫苗研究進展29-35
• 5.1 布魯氏菌病主要的弱毒苗及滅活苗30-31
• 5.2 布魯氏菌亞單位疫苗31-32
• 5.3 載體疫苗32-33
• 5.4 DNA疫苗33
• 5.5 布氏菌外膜囊泡疫苗33-35
• 第二章 試驗研究35-71
• 實驗一 羊種布魯氏菌015株gmd、per、manb基因缺失株的構(gòu)建35-53
• 摘要35-36
• 1 材料與方法36-44
• 1.1 材料36-37
• 1.1.1 菌株來源、載體36
• 1.1.2 主要試劑36
• 1.1.3 主要實驗儀器36-37
• 1.1.4 培養(yǎng)基37
• 1.2 方法37-44
• 1.2.1 目的基因的PCR擴增37-38
• 1.2.2 目的基因回收38
• 1.2.3 目的基因與pMD19-T載體的連接38-39
• 1.2.4 連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化39-40
• 1.2.5 重組質(zhì)粒的菌液PCR鑒定40
• 1.2.6 陽性單克隆的擴繁40
• 1.2.7 重組質(zhì)粒的提取40
• 1.2.8 重組質(zhì)粒的鑒定40
• 1.2.9 自殺載體的構(gòu)建40-41
• 1.2.10 重組自殺載體的酶切鑒定41
• 1.2.11 測序41
• 1.2.12 重組自殺質(zhì)粒pgs、pps、pms的電轉(zhuǎn)41-42
• 1.2.13 同源重組子的篩選42-44
• 2 結(jié)果44-50
• 2.1 布魯氏菌 015 Δgmd、Δper、Δmanb缺失株的構(gòu)建44-48
• 2.1.1 同源重組質(zhì)粒pgs、pps、pms的構(gòu)建44-45
• 2.1.2 同源重組質(zhì)粒pgs、pps、pms的酶切鑒定45-46
• 2.1.3 Δgmd、Δper、Δmanb的一次篩選46-47
• 2.1.4 Δgmd、Δper、Δmanb的二次篩選47-48
• 2.2 缺失株Δgmd、Δper、Δmanb的遺傳穩(wěn)定性檢測48-50
• 3 討論50-51
• 3.1 同源重組子的構(gòu)建50-51
• 3.2 電轉(zhuǎn)條件的優(yōu)化51
• 3.3 無痕敲除構(gòu)建突變株51
• 4 小結(jié)51-53
• 實驗二 羊種布魯氏菌 015Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力評價53-62
• 摘要53
• 1 材料與方法53-57
• 1.1 材料53-54
• 1.1.1 菌株來源53-54
• 1.1.2 實驗細胞及動物54
• 1.1.3 主要試劑和儀器54
• 1.2 實驗方法54-57
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)液和PBS緩沖液的配制54
• 1.2.2 RAW264.7 細胞的培養(yǎng)54-55
• 1.2.3 細胞計數(shù)55
• 1.2.4 菌株的培養(yǎng)及計數(shù)55
• 1.2.5 Δmanb、Δper和Δgmd缺失株的毒力初步評價55-57
• 2 結(jié)果57-59
• 2.1 基因缺失對布魯氏菌毒力的影響57-58
• 2.1.1 缺失株在小鼠巨噬細胞RAW264.7 內(nèi)的增殖57
• 2.1.2 缺失株在小鼠體內(nèi)的存活情況57-58
• 2.3 菌株誘導機體抗體水平差異(IgG)58-59
• 2.4 菌株誘導機體產(chǎn)生INF-γ的差異59
• 3 討論59-61
• 3.1 缺失株毒力評價60
• 3.2 per、gmd和manb基因?qū)γ庖咴缘挠绊?/span>60-61
• 4 小結(jié)61-62
• 實驗三 布魯氏菌gmd、per和manb基因的原核表達62-71
• 摘要62
• 1 材料與方法62-66
• 1.1 材料62-63
• 1.1.1 菌株與載體62-63
• 1.1.2 酶、主要試劑63
• 1.1.3 主要儀器63
• 1.2 方法63-66
• 1.2.1 gmd、per、manb基因的擴增63-64
• 1.2.2 gmd、per和manb基因的連接與轉(zhuǎn)化64
• 1.2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定64
• 1.2.4 pET-28a-gmd、pET-28a-per和pET-28a-manb表達載體的構(gòu)建64-65
• 1.2.5 gmd、per和manb蛋白的表達65
• 1.2.6 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）65-66
• 1.2.7 Western blot分析66
• 2 結(jié)果66-69
• 2.1 目的基因的擴增66-67
• 2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定67-68
• 2.3 gmd、per和manb蛋白的表達68-69
• 2.4 Western blot驗證蛋白的反應原性69
• 3 討論69-70
• 4 小結(jié)70-71
• 參考文獻71-79
• 致謝79-80
• 作者簡介80
• 在學期間主要參與的研究項目80
• 在學期間發(fā)表的文章80-81
• 附件81

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本文編號：754393