本文關(guān)鍵詞：農(nóng)桿菌介導(dǎo)抗菌肽Rev4基因的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立

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【摘要】：紫花苜蓿(Medicago.Sativa.L)以“牧草之王”著稱(chēng),是世界上分布最廣的優(yōu)良牧草。長(zhǎng)期以來(lái),人們圍繞經(jīng)濟(jì)有效地提高紫花苜蓿產(chǎn)量和質(zhì)量?jī)纱竽繕?biāo)進(jìn)行了不懈的努力。傳統(tǒng)育種方法時(shí)間長(zhǎng)、成本高且可利用的種質(zhì)資源有限。植物基因工程更具有科學(xué)性和準(zhǔn)確性。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法是目前研究最多、使用頻率最高的方法之一。Indolicidin是一個(gè)13殘基酰胺肽(IL-PWKWPWWPWRR-NH2),最初分離自牛嗜中性粒細(xì)胞的胞漿小顆粒,具有廣譜抗細(xì)菌活性和抗病毒活性。抗菌肽Rev4是根據(jù)Indolicidin設(shè)計(jì)的反向類(lèi)似物。本實(shí)驗(yàn)以紫花苜蓿種子為外植體,利用根癌農(nóng)桿菌A.GV3850介導(dǎo)的種子整體侵染法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化。首先將侵染后的紫花苜蓿種子經(jīng)卡那霉素75mg/L(Kan75)壓力篩選45 d左右,獲得68株具有卡那抗性的苜蓿植株。提取抗性植株的基因組,并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增分析,其中有40株抗性植株的PCR檢測(cè)為陽(yáng)性,將PCR產(chǎn)物回收后,由北京華大基因有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。將測(cè)序成功的結(jié)果在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站中進(jìn)行序列對(duì)比與分析,我們利用Nucleotide Blast,成功鑒定13株轉(zhuǎn)Rev4基因的苜蓿植株。以外施濃度為8mmol/L的水楊酸誘導(dǎo)Rev4基因表達(dá),通過(guò)半定量RT-PCR對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行基因表達(dá)分析,確定抗菌肽Rev4基因在轉(zhuǎn)化植株中成功表達(dá)。本研究利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿種子整體侵染法,成功地將抗菌肽Rev4基因轉(zhuǎn)入紫花苜蓿,獲得13株轉(zhuǎn)基因株系,其中10株成功表達(dá)。該整體侵染法是本實(shí)驗(yàn)室具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的專(zhuān)利技術(shù),具有轉(zhuǎn)化率高、實(shí)驗(yàn)周期短、實(shí)驗(yàn)工作量少等優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)抗菌肽苜蓿將大大提高苜�？共⌒浴⒖瓜x(chóng)性以及產(chǎn)量,同時(shí)在動(dòng)物飼料工業(yè)中將具有巨大的潛力與優(yōu)勢(shì),轉(zhuǎn)抗菌肽Rev4的紫花苜蓿作為飼料可清除動(dòng)物體內(nèi)有害病毒、細(xì)菌及真菌,顯著降低腸道疾病發(fā)生,提高牲畜的抗病性以及提高肉質(zhì)�？咕氖欠菍�(zhuān)一的免疫應(yīng)答物質(zhì),因此,抗菌肽將極大地減少產(chǎn)生耐藥性的可能。轉(zhuǎn)抗菌肽苜�？砂l(fā)展為綠色養(yǎng)殖專(zhuān)用飼料,這不僅具有重大的生態(tài)效益,同時(shí)具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
【關(guān)鍵詞】：紫花苜蓿 整體侵染法 抗菌肽 分子鑒定
【學(xué)位授予單位】：吉林師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：S541.9
【目錄】：

• 摘要4-5
• Abstract5-10
• 第一章 文獻(xiàn)綜述10-21
• 1.1 植物遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展10-13
• 1.1.1 植物遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)制10
• 1.1.2 植物遺傳轉(zhuǎn)化方法10-13
• 1.2 苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展13-16
• 1.2.1 苜蓿概述13-14
• 1.2.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化機(jī)理14-15
• 1.2.3 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化的影響因素15-16
• 1.3 抗菌肽研究現(xiàn)狀16-21
• 1.3.1 抗菌肽簡(jiǎn)介16-17
• 1.3.2 抗菌肽作用機(jī)制17-18
• 1.3.3 抗菌肽Rev4在植物遺傳轉(zhuǎn)化中的研究進(jìn)展18-21
• 第二章 材料與方法21-26
• 2.1 材料21-23
• 2.1.1 菌種和質(zhì)粒21
• 2.1.2 植物材料21
• 2.1.3 PCR擴(kuò)增引物序列21
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)試劑21-22
• 2.1.5 主要儀器設(shè)備22
• 2.1.6 培養(yǎng)基配方22-23
• 2.2 方法23-26
• 2.2.1 紫花苜蓿整體轉(zhuǎn)化法體系23-24
• 2.2.1.1 菌種活化23
• 2.2.1.2 苜蓿種子消毒23-24
• 2.2.1.3 侵染24
• 2.2.1.4 共培養(yǎng)24
• 2.2.1.5 抗性轉(zhuǎn)化植株的獲得24
• 2.2.2 轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定24-26
• 2.2.2.1 總DNA的提取24
• 2.2.2.2 PCR擴(kuò)增24
• 2.2.2.3 PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定24-25
• 2.2.2.4 總RNA的提取25
• 2.2.2.5 RT-PCR25-26
• 第三章 結(jié)果與分析26-37
• 3.1 紫花苜蓿轉(zhuǎn)抗菌肽Rev4體系的建立26-27
• 3.1.1 紫花苜蓿種子整體侵染法26
• 3.1.2 轉(zhuǎn)抗菌肽基因抗性植株的獲得26
• 3.1.3 抗性植株的移栽26-27
• 3.2 轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定27-28
• 3.2.1 紫花苜�；蚪M的提取27
• 3.2.2 抗菌肽基因的PCR鑒定27-28
• 3.3 PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定3.4 轉(zhuǎn)化植株的半定量RT-PCR鑒定28-34
• 3.4 轉(zhuǎn)化植株的 RT-PCR 鑒定34-37
• 3.4.1 苜蓿總RNA提取34-35
• 3.4.2 RT-PCR分析35-37
• 第四章 討論37-40
• 4.1 紫花苜蓿種子整體侵染法37
• 4.2 抗菌肽基因pKLP36-PcRIL PCR程序的優(yōu)化37
• 4.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果討論37-38
• 4.4 苜蓿RNA提取方案的優(yōu)化38-39
• 4.5 外源水楊酸誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)39-40
• 結(jié)論40-42
• 參考文獻(xiàn)42-48
• 攻讀碩士期間發(fā)表的主要科研成果48-50
• 后記50

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐建;根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的F3’5’H基因?qū)栈ㄟz傳轉(zhuǎn)化的初步研究[D];西南大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：717144