本文關(guān)鍵詞：來源于Caldibacillus cellulovorans的耐熱甘露聚糖酶的全基因合成，，表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)分析

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【摘要】：甘露聚糖酶(mannanase)來源廣泛,大量存在于植物,動物和微生物。其中微生物存在種類繁多、性質(zhì)優(yōu)良的甘露聚糖酶,且易于培養(yǎng),是理想的β-甘露聚糖酶來源。已有大量來源于細(xì)菌的甘露聚糖酶被研究,其中耐熱甘露聚糖酶的研究仍受到科學(xué)家們的關(guān)注。在食品、飼料等眾多行業(yè)中,需要大量高溫環(huán)境下使用的生物活性添加劑,其相關(guān)高反應(yīng)溫度,耐熱性好的酶類仍然缺乏研究。國內(nèi)外已有研究出的耐熱甘露聚糖酶,目前還沒有能夠得到很好推廣利用,應(yīng)用很有限,其原因是市場供給不足,酶學(xué)性質(zhì)難以工業(yè)化使用,并且價(jià)格高。挖掘出耐熱效率高并利用高效表達(dá)系統(tǒng)使該甘露聚糖酶進(jìn)行外源高效率表達(dá),從而低成本、規(guī)�；卮罅可a(chǎn)甘露聚糖酶酶供更多人所用,無疑是解決這一問題的有效方法之一。本研究應(yīng)用基因工程,蛋白工程和發(fā)酵工程技術(shù)獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的甘露聚糖酶高產(chǎn)工程菌,為甘露聚糖酶在食品與飼料方向的工業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和條件,本研究主要工作包括以下內(nèi)容:在不改變耐熱甘露聚糖酶ManAd3原始氨基酸序列的基礎(chǔ)上,根據(jù)已知耐熱甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列,為了提高甘露聚糖酶在巴斯德畢赤酵母中的表達(dá)量,參照巴斯德畢赤酵母密碼子使用情況,優(yōu)先選擇畢赤酵母最偏愛的密碼子,部分使用次偏好密碼子,從而盡量消除mRNA穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)并全基因合成了甘露聚糖酶基因ManAHr(Accession No.KJ806637)。將人工合成的甘露聚糖酶基因ManAHr利用基因工程技術(shù)與pPIC9k質(zhì)粒進(jìn)行連接,構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)載體pPIC9k-ManAHr,并將其轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115得到重組子,該重組菌株發(fā)酵產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE鑒定,其中甘露聚糖酶ManAHr含量達(dá)到電泳純級別,分子量大小約為30 kDa。通過發(fā)酵罐發(fā)酵條件的優(yōu)化,尋找重組蛋白的表達(dá)的最佳發(fā)酵條件,通過甲醇與甘油不同比例的混合補(bǔ)料,有效的避免了甲醇中毒情況,進(jìn)一步提高了甘露聚糖酶的產(chǎn)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,重組甘露聚糖酶酶學(xué)性質(zhì)檢測結(jié)果顯示該酶最適反應(yīng)溫度為75°C,最適反應(yīng)pH為6.0,比活力高達(dá)3200 IU/mg,并且在75°C下處理30 min仍能維持90%以上相對酶活力。該甘露聚糖酶ManAHr因表達(dá)量較高,在偏酸性環(huán)境下仍能夠維持較高的相對酶活力,且熱穩(wěn)定性顯著,可廣泛應(yīng)用于食品、釀造、飼料、紡織和醫(yī)藥等工業(yè)領(lǐng)域,根據(jù)目前發(fā)酵罐小試的產(chǎn)量,在工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)中前景廣泛。
【關(guān)鍵詞】：甘露聚糖酶 畢赤酵母 基因合成 耐熱性 發(fā)酵罐
【學(xué)位授予單位】：中南民族大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：Q55
【目錄】：

• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 前言12-20
• 1.1 甘露聚糖12-14
• 1.1.1 甘露糖的來源和分類12-13
• 1.1.2 甘露糖的作用13-14
• 1.2 甘露聚糖酶14-17
• 1.2.1 β-甘露聚糖酶的來源及其性質(zhì)14-15
• 1.2.2 β-甘露聚糖酶的分離純化15-16
• 1.2.3 β-甘露聚糖酶酶活分析16
• 1.2.4 β-甘露聚糖酶的應(yīng)用16-17
• 1.3 外源基因表達(dá)系統(tǒng)17-19
• 1.3.1 巴斯德畢赤酵母簡介17-18
• 1.3.2 表達(dá)載體18-19
• 1.4 研究目的和意義19-20
• 第二章 甘露聚糖酶ManAHr在畢赤酵母中的表達(dá)20-36
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1 菌種與質(zhì)粒20
• 2.1.2 引物合成20
• 2.1.3 工具酶和生化試劑20
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器20-21
• 2.1.5 實(shí)驗(yàn)相關(guān)培養(yǎng)基21
• 2.1.6 實(shí)驗(yàn)相關(guān)溶液21-22
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法22-29
• 2.2.1 甘露聚糖酶基因ManAHr的改造設(shè)計(jì)22-23
• 2.2.2 甘露聚糖酶ManAHr的載體構(gòu)建23-24
• 2.2.3 甘露聚糖酶ManAHr表達(dá)載體的構(gòu)建24-26
• 2.2.4 甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)26-28
• 2.2.5 目標(biāo)蛋白SDS-PAGE的分析28-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析29-34
• 2.3.1 甘露聚糖酶基因ManAHr的改造設(shè)計(jì)29
• 2.3.2 甘露聚糖酶ManAHr表達(dá)載體的構(gòu)建29-32
• 2.3.3 甘露聚糖酶基因在畢赤酵母中表達(dá)32-34
• 2.3.4 目標(biāo)蛋白SDS-PAGE的分析34
• 2.4 本章小結(jié)34-36
• 第三章 甘露聚糖酶ManAHr酶學(xué)性質(zhì)的鑒定36-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料36
• 3.1.1 菌種36
• 3.1.2 工具酶和生化試劑36
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器36
• 3.1.4 常用溶液36
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 3.2.1 甘露糖及蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制度36-37
• 3.2.2 最適pH的測定37
• 3.2.3 甘露聚糖酶ManAHr的最適反應(yīng)溫度檢測37
• 3.2.4 甘露聚糖酶ManAHr的熱穩(wěn)定性檢測37-38
• 3.2.5 發(fā)酵上清液中甘露聚糖酶含量的檢測38
• 3.3 結(jié)果與分析38-40
• 3.4 本章小結(jié)40-42
• 第四章 甘露聚糖酶ManAHr發(fā)酵罐水平表達(dá)及發(fā)酵條件優(yōu)化42-49
• 4.1 發(fā)酵條件優(yōu)化簡介42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)材料42
• 4.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種42
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)試劑42
• 4.2.3 常用溶液42
• 4.3 實(shí)驗(yàn)儀器42-43
• 4.4 實(shí)驗(yàn)方法43-44
• 4.4.1 種子搖瓶培養(yǎng)43
• 4.4.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化43-44
• 4.4.3 菌體濃度檢測方法44
• 4.4.4 蛋白含量的測定44
• 4.4.5 干熱噴霧干燥處理44
• 4.5 結(jié)果與分析44-48
• 4.5.1 甘油補(bǔ)料44-46
• 4.5.2 甲醇補(bǔ)料46-47
• 4.5.3 噴霧干燥47-48
• 4.6 本章小結(jié)48-49
• 結(jié)論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-55
• 致謝55-56
• 附錄56-59
• 研究生期間發(fā)表的文章59

本文編號：614585