【摘要】：石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）是一種毒性極強(qiáng)的胍胺類神經(jīng)毒素，是有害赤潮發(fā)生過程海水中一種重要的致害因子。STX主要來源于海水或淡水中某些有害浮游生物的二次代謝產(chǎn)物，并通過食物鏈蓄積于貝類、蟹類等水產(chǎn)品中。當(dāng)人類或動物攝食被毒素污染的水產(chǎn)品，就會引起麻痹、死亡等中毒反應(yīng)。近年來，海洋污染問題日益嚴(yán)重，有害藻華（HAB）和赤潮頻繁發(fā)生，致使有毒水產(chǎn)品中毒事件在世界范圍內(nèi)時有發(fā)生。為了保障公眾的身體健康不受毒素隱患的威脅，必須加強(qiáng)對STX等貝類毒素的檢測和監(jiān)管工作。目前，STX的檢測方法主要有生物毒性試驗法、高效液相色譜分析法，細(xì)胞毒性試驗法，免疫學(xué)測定法等，這些檢測方法都存在一定的缺陷和不足。如試驗不夠靈敏，需要昂貴的設(shè)備儀器及高素質(zhì)的操作人員，毒素標(biāo)準(zhǔn)品價格昂貴等。為解決以上問題迫切需要尋找一種靈敏、特異、方便、無毒的STX檢測方法。本研究旨在利用STX和STX單抗為靶標(biāo)分子，通過SELEX技術(shù)篩選STX和STX單抗的特異性適配子，建立基于適配子的STX無毒ELISA檢測方法，為深化我國海洋環(huán)境學(xué)研究和開發(fā)具有自主知識產(chǎn)權(quán)的無毒快速檢測試劑盒提供試驗基礎(chǔ)。 為了篩選STX特異性適配子，我們設(shè)計并合成了一個長度為81個核苷酸的ssDNA文庫，文庫的中間含有40個堿基的隨機(jī)序列，兩端為固定序列。同時，設(shè)計一段與ssDNA文庫固定序列部分互補(bǔ)的固定探針，該核酸分子的末端依據(jù)微孔板表面的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行相應(yīng)化學(xué)修飾，以便連接固定到微孔板表面。利用固定探針將ssDNA文庫固定在微孔板上，以STX為靶標(biāo)分子，采用靶標(biāo)誘導(dǎo)變構(gòu)解離SELEX技術(shù)篩選STX的適配子。經(jīng)過15輪的反復(fù)篩選、富集過程，獲得與STX高親和力的適配子富集文庫。對富集文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序。通過DNAMAN軟件和mfold網(wǎng)站對獲得的適配子序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過間接ELISA和競爭ELISA方法對獲得的適配子序列進(jìn)行親和力和特異性分析，最終獲得3個具有較高特異性和親和力的STX適配子。 同時，我們采用微孔板SELEX技術(shù)對STX抗體F(ab′)2片段適配子進(jìn)行了篩選。經(jīng)過16輪的反復(fù)篩選、富集過程，獲得與STX抗體F(ab′)2片段高親和力的適配子富集文庫。對富集文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化和克隆測序。通過DNAMAN軟件和mfold網(wǎng)站對獲得的適配子序列進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)同源性分析及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。通過間接ELISA和競爭ELISA方法對獲得的適配子序列進(jìn)行親和力和特異性分析，并采用超濾和競爭ELISA方法對以上鑒定的優(yōu)勢適配子的復(fù)合物形成能力和特異性進(jìn)一步分析，最終成功獲得了一個能夠模擬STX與STX抗體結(jié)合的適配子。 基于靶標(biāo)誘導(dǎo)變構(gòu)解離SELEX篩選模式，我們設(shè)計了一種適配子變構(gòu)解離的STX無毒ELISA檢測方法。利用STX與STX適配子能夠特異性結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象改變的原理，，結(jié)合微孔板核酸雜交技術(shù)和生物素-親和素-辣根過氧化物酶顯色系統(tǒng)實現(xiàn)對STX的無毒檢測。并對該檢測方法中固定探針長度、適配子濃度、洗滌緩沖液中鹽離子濃度等條件進(jìn)行了優(yōu)化，完成標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制，得到線性回歸方程為y=-6.4916x+99.006，相關(guān)系數(shù)R2=0.9959，線性檢測范圍為3.92～1600ng/mL，最低檢測限為3.92ng/mL。此外，我們對STX與STX抗體適配子對應(yīng)關(guān)系進(jìn)行了線性回歸分析，分析表明STX標(biāo)準(zhǔn)品濃度與STX抗體適配子濃度之間有相關(guān)性，為建立STX抗體適配子替代STX的ELISA檢測方法奠定基礎(chǔ)。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：TS207.5

【引證文獻(xiàn)】

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1 張松山;李慶鵬;靳靜;哈益明;;麻痹性貝類毒素常規(guī)檢測分析方法比較與研究進(jìn)展[J];食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報;2014年03期

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2 田瑞云;短裸甲藻毒素-2適配子的制備及在檢測中的初步應(yīng)用[D];吉林大學(xué);2014年

本文編號：2445098