本文關(guān)鍵詞： 轉(zhuǎn)座子 進化 轉(zhuǎn)座活性 斑馬魚 硬骨魚　出處：《揚州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Tc1轉(zhuǎn)座子超家族廣泛分布于細菌、真菌及昆蟲等各種生物中,有些Tc1轉(zhuǎn)座子超家族成員已經(jīng)被開發(fā)為重要的遺傳育種操作工具,如SB轉(zhuǎn)座子已經(jīng)作為基因治療和轉(zhuǎn)基因的介導(dǎo)載體得到廣泛應(yīng)用。pogo轉(zhuǎn)座子是Tc1轉(zhuǎn)座子超家族的重要成員,但對其分布、進化和活性研究報道很少。本研究通過硬骨魚轉(zhuǎn)座組注釋,并在脊椎動物中針對Tc1轉(zhuǎn)座子超家族的重要成員pogo轉(zhuǎn)座子進行分布、進化和活性研究,以挖掘活性pogo轉(zhuǎn)座子,研發(fā)自主知識產(chǎn)權(quán)的遺傳操作工具,為動物轉(zhuǎn)基因和基因治療等研究提供技術(shù)支撐。主要研究內(nèi)容如下:(1)通過生物信息學(xué)手段對9種硬骨魚轉(zhuǎn)座組進行注釋。結(jié)果表明9種硬骨魚類轉(zhuǎn)座組大小和構(gòu)成差異顯著,其轉(zhuǎn)座組含量從高到低分別為斑馬魚、矛尾魚、青溕魚、花斑劍尾魚、大西洋鱈魚、三刺魚、金娃娃、羅非魚和紅鰭東方渶,轉(zhuǎn)座子含量和基因組大小呈正相關(guān)。DNA轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類中具有多樣性高和含量差異大的特點(0.50%-38.37%),是硬骨魚類轉(zhuǎn)座組差異的主要決定因素,其中hAT和Tc/Mariner超家族是硬骨魚類主要的DNA轉(zhuǎn)座子。RNA轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類中也具有多樣性高的特點,其中LINE轉(zhuǎn)座子占硬骨魚類基因組0.53%-5.66%,共檢測到 12 個(I、CR1、L1、L2、R1、R2、Jockey、RTE 和Rex)超家族分布,其中L1、L2、RTE和Rex轉(zhuǎn)座子擴增較為明顯,LTR轉(zhuǎn)座子除了在斑馬魚和三刺魚中含量達到、5.58%和2.51%,在大多硬骨魚類基因組中的含量低于2%,在硬骨魚類中共檢測到6個LTR轉(zhuǎn)座子(Copia、DIRS、ERV、Gypsy、Ngaro和Pao)超家族分布,其中擴增最為明顯的是Gypsy。而SINE轉(zhuǎn)座子在硬骨魚類中擴增最弱,僅在斑馬魚和矛尾魚中分別達到3.28%和5.64%,在其它7個品種中低于1%。SINE中tRNA、5S和MIR三個超家族在部分硬骨魚類中有一定程度擴增。本研究表明硬骨魚類轉(zhuǎn)座組具有多樣性豐富、差異大的特點,轉(zhuǎn)座組差異與硬骨魚基因組大小有很強的相關(guān),轉(zhuǎn)座組是決定硬骨魚基因組大小的重要因素。(2)通過TBLAST程序?qū)CBI數(shù)據(jù)庫中脊椎動物基因組比對發(fā)現(xiàn)pogo轉(zhuǎn)座子主要分布在魚類基因組中,其中在28個魚物種中發(fā)現(xiàn)了 pogo轉(zhuǎn)座子的分布,在2種兩棲動物(西方爪蛙和高山蛙)和4種爬行動物中發(fā)現(xiàn)了 pogo轉(zhuǎn)座子的分布,在鳥類和哺乳動物未能發(fā)現(xiàn)者典型的pogo轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)。pogo轉(zhuǎn)座子在進化中衍生出POGK和POGZ功能基因,POGZ在脊椎動物中分布廣泛,而POGK主要分布在哺乳動物中。POGK和POGZ功能基因含有保守的pogo轉(zhuǎn)座酶DBD和DDE結(jié)構(gòu)域,且DDE氨基酸殘基高度保守,提示POGK和POGZ可能具有DNA酶活性。(3)為驗證人源POGK和POGZ在哺乳動物細胞上的活性,構(gòu)建了 pogo轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的新霉素報告基因表達質(zhì)粒pPG-PGK-NEO,及轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ,同時構(gòu)建斑馬魚pogo轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒pT2-CMV-Pgase。將pPG-PGK-NEO與分別上述三個轉(zhuǎn)座酶表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Hela細胞,通過G418篩選獲得穩(wěn)定表達Neo-基因的陽性細胞,陽性細胞克隆數(shù)比較表明,pT2-CMV-POGK和pT2-CMV-POGZ組顯著高于對照組,而pT2-CMV-Pgase組顯著高于POGK、POGZ和對照組,提示pogo轉(zhuǎn)座酶、POGK、POGZ基因均具有轉(zhuǎn)座活性。(4)為了進一步明確斑馬魚pogo轉(zhuǎn)座酶PGase轉(zhuǎn)座子時空表達特性,以PGase正、反義RNA為探針,對不同發(fā)育階段的斑馬魚胚胎進行原位雜交,結(jié)果表明,PGase在胚胎早期發(fā)育各階段具有表達活性,正向表達水平明顯高于反向,且表達無明顯組織特異性,本研究表明,pogo轉(zhuǎn)座子主要分布在魚類、兩棲類和爬行類動物中,具有較高的轉(zhuǎn)座活性,且其衍生基因POGK和POGZ也具有轉(zhuǎn)座活性。
[Abstract]:The Tc1 transposon superfamily are widely distributed in bacteria, fungi and insects and other organisms, some of the Tc1 transposon superfamily has been developed as an important tool for genetic breeding operation, such as the SB transposon has been used as gene therapy and transgenic vector mediated widely used transposon.Pogo is an important member of Tc1 transposon superfamily but, the distribution, evolution and activity are rarely reported. This study through the teleost transposable group notes, pogo and important members in vertebrates for Tc1 transposon superfamily transposons distribution, evolution and research activity, in order to tap the active pogo transposon, genetic manipulation tool research and independent intellectual property rights. Provide technical support for the research of transgenic animal and gene therapy. The main contents are as follows: (1) notes on 9 species of teleost fish transposable group by means of bioinformatics. The results show that 9 kinds of hard Fish bone transposition group size and constitute a significant difference, the transposition group content from high to low was the fish, green Mengyu, Latimeria chalumnae, Xiphophorus maculatus, the Atlantic cod, three fish, gold doll, tilapia and t.rubripes Ying, transposon content and genome size of Cheng Zhengxiang.DNA transposon has the characteristics of diversity and high the content in teleost fishes (0.50%-38.37%), is a major determinant of differences in teleost transposable group factors, including hAT and Tc/Mariner superfamily is DNA major teleost transposon.RNA also has the characteristics of high diversity in teleost fishes, which accounted for LINE transposon in teleost genomic 0.53%-5.66% were detected 12 (I, CR1, L1, L2, R1, R2, Jockey, RTE and Rex) super family distribution, which L1, L2, RTE and Rex transposon was more obvious, LTR transposon except in zebrafish and three spined stickleback in content reached 5.5. 8% and 2.51%, in most teleost fish genome content of less than 2%, in the teleost were detected 6 transposon LTR (Copia, DIRS, ERV, Gypsy, Ngaro and Pao) super family distribution, which was the most obvious is the Gypsy. and SINE transposon in teleosts was the most weak, 3.28% and 5.64% respectively in zebrafish and Latimeria chalumnae, in the other 7 varieties in less than 1%.SINE in tRNA, 5S and MIR three superfamily in teleosts in part with a certain degree of amplification. This study shows that teleost transposable group has rich diversity, the characteristics of big differences, there is a strong correlation of transposition group differences and teleost genomes, transposable group is an important factor in determining the teleost genome size. (2) through the TBLAST program of NCBI database in the vertebrate genome comparison showed that pogo transposon is mainly distributed in the fish genome, one in 28 fish species Found in the distribution of pogo transposon, 2 species of amphibians in animal (Western clawed frog and alpine frog) and 4 reptile species were found in the distribution of pogo transposon in birds and mammals, who failed to find the typical pogo transposon structure of.Pogo transposon in evolution derived from POGK and POGZ genes, POGZ in vertebrates, POGK mainly.POGK in mammals and POGZ genes containing pogo transposase DBD and DDE conserved domains, and highly conserved amino acid residue DDE, suggesting that POGK and POGZ may have DNA activity. (3) in order to verify the witness source POGK and POGZ in mammalian cells activity. The construction of gene expression vector pPG-PGK-NEO neomycin report pogo transposon mediated, and transposase expression plasmid pT2-CMV-POGK and pT2-CMV-POGZ, and construct the zebrafish pogo transposase expression plasmid pT2-CMV-Pgase. pPG-PGK-NEO And respectively above three transposase expression plasmids were transfected into Hela cells by G418 screening for stable expression of Neo- gene positive cells, positive cells number comparison showed that pT2-CMV-POGK and pT2-CMV-POGZ were significantly higher than the control group, and pT2-CMV-Pgase group was significantly higher than that of POGK, POGZ and the control group, suggesting that pogo transposase, POGK, POGZ gene transposition activity. (4) in order to further clarify the zebrafish pogo transposase PGase transposon expression characteristics, PGase, antisense RNA probe of zebrafish embryos at different developmental stages by in situ hybridization. The results show that PGase has expression in the early stages of embryonic development, the positive expression level was significantly higher than that of the reverse. And the expression had no obvious tissue specificity, this study showed that pogo transposon mainly distributed in fish, amphibians and reptiles in animal, transposition activity is high, and its derivative matrix POGK and POGZ also have transposable activity.

【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：Q78

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本文編號：1463083