本文關(guān)鍵詞：PCR法檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應(yīng)用

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【摘要】：目的：溺死(drowning)是機械性死亡的一種。我國河道水網(wǎng)密集,水中尸體多發(fā),在江河湖海中發(fā)現(xiàn)的尸體可能屬于意外溺水死亡,但也可能為自殺或他殺,也不排除死后拋尸入水偽造意外溺水身亡,因此水中尸體可能與刑事案件相關(guān),必須進行法醫(yī)學(xué)鑒定。溺死的鑒定及對其實用性、科學(xué)性的評價是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域長期以來的重要課題之一。確定生前入水和死后入水是解決溺死類案件的關(guān)鍵,由于其他生物學(xué)和尸體化學(xué)的溺死檢驗指標(biāo)尚未得到科學(xué)的確認(rèn),因此,硅藻檢驗仍是目前鑒定溺死的“金標(biāo)準(zhǔn)”。近年來,對溺死的相關(guān)報道主要集中于不同水域溺死案件的鑒定或回顧性研究,且主要著重于尸體臟器中硅藻的檢出及檢出率比較,對傳統(tǒng)硅藻提取、檢測方法的改良及優(yōu)缺點比較,而忽略臟器內(nèi)硅藻種類與溺死地點硅藻種類的比較及新的、靈敏度高、特異性強的硅藻檢驗方法的探索。本研究主要通過酶消化法分離硅藻,在保證操作者安全的同時,減少硅藻的破壞和損失；硅藻DNA的提取使用MoBio強力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit),能高效提取硅藻基因組DNA,且DNA純度高,可直接用于下游實驗；選用硅藻特異性引物,通過PCR法擴增硅藻SSU基因,通過瓊脂糖凝膠電泳及PCR產(chǎn)物測序,驗證引物特異性。DHPLC法不僅可以對PCR產(chǎn)物的片段大小進行分析,還能對PCR產(chǎn)物的構(gòu)象及堿基組成比例進行檢測分析,因此本研究采用DHPLC法(高效變性液相色譜法)對溺死人體臟器及溺死地點水樣中的硅藻進行分析,區(qū)分不同水域硅藻種屬,為判斷溺死人體臟器內(nèi)硅藻種屬與溺死地點硅藻種屬是否相同提供依據(jù),具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點。此外,本研究中還應(yīng)用了毛細(xì)管電泳檢測硅藻SSU基因,此法也具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)點,毛細(xì)管電泳法因其應(yīng)用廣泛、操作簡單,因此在溺死鑒定和溺死地點推斷中易普及推廣,為硅藻檢驗提供了一種新方法、新思路。 方法：把實驗動物60只隨機分成3組,分別為生前溺死(水中溺斃)、死后入水(空氣栓塞致死后入水)、對照組(空氣栓塞致死后不做處理),每組20只；從廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所獲取溺死診斷陽性人體臟器組織30份,包括肺、肝、腎組織,提取各組織檢材硅藻DNA,PCR擴增硅藻特異的核糖體小亞基(SSU)片段,用瓊脂糖凝膠電泳檢測、PCR-DHPLC檢測、PCR-CE檢測分析,評估PCR-DHPLC法和PCR-CE檢測硅藻SSU基因在溺死鑒定中的應(yīng)用價值。 結(jié)果：在動物實驗中,生前溺死組肺、肝、腎硅藻檢出率分別為100%、90%、85%,死后入水組僅肺檢出硅藻(15%),對照組各組織均為陰性；生前溺死組檢出率明顯高于死后入水組(P0.05)。通過PCR-CE法對20只溺死實驗動物的肝、腎、肺進行檢驗,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著檢材量的增加,檢出的硅藻種類數(shù)增加,且均存在正相關(guān)；肺內(nèi)檢出硅藻種類與檢材量的相關(guān)系數(shù)是0.433(P0.01),肝內(nèi)檢出硅藻種類與檢材量的相關(guān)系數(shù)是0.623(P0.01),腎內(nèi)檢出硅藻種類與檢材量的相關(guān)系數(shù)是0.613(P0.01)。當(dāng)檢材量大于0.9g時,肺內(nèi)檢出硅藻種類以2種及2種以上為主；當(dāng)檢材量大于1.5g時,肝內(nèi)檢出硅藻種類以1種及1種以上為主；當(dāng)檢材量大于2g時,腎內(nèi)檢出硅藻種類以1種及1種以上為主。20例溺死診斷陽性的人體器官組織檢材用PCR-CE法檢出硅藻種類明顯多于微波消解-掃描電鏡法(P0.05)。10例溺死診斷陽性的人體器官組織檢材用DHPLC法檢出硅藻種類明顯多于微波消解-掃描電鏡法(P0.05)。 結(jié)論：PCR-DHPLC法是一種新的診斷溺死的方法,此法具有靈敏度高、特異性強的優(yōu)勢；PCR-DHPLC法可對不同硅藻種屬進行分離和鑒定,不僅準(zhǔn)確性高、可信度強,還能為判斷溺死人體臟器內(nèi)硅藻種屬與溺死地點硅藻種屬是否相同提供依據(jù),從而為溺死鑒定和溺死地點推斷提供較好的方法和平臺。通過PCR-CE法檢測硅藻SSU基因,具有很強的靈敏度和特異性,且具有較好的普及性和推廣性,為法醫(yī)學(xué)硅藻檢驗提供了一條新思路。
【關(guān)鍵詞】：法醫(yī)病理學(xué) 溺死 硅藻檢驗 SSU PCR DHPLC CE
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：D919
【目錄】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-12
• 第一章 引言12-20
• 1.1 溺死及溺死鑒定的意義12-13
• 1.2 硅藻提取及檢測方法的分類及發(fā)展13-15
• 1.3 硅藻檢驗的現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢15-17
• 1.4 硅藻DNA檢驗的優(yōu)勢17-18
• 1.5 立項依據(jù)及研究思路18-20
• 第二章 PCR-Agarose電泳檢測硅藻SSU基因方法建立20-29
• 2.1 材料20-22
• 2.1.1 主要儀器20-21
• 2.1.2 主要試劑及耗材21-22
• 2.1.3 實驗動物分組22
• 2.1.4 模型制作22
• 2.1.5 樣本來源22
• 2.2 方法22-26
• 2.2.1 組織中硅藻分離方法22-23
• 2.2.2 水樣硅藻分離方法23
• 2.2.3 硅藻DNA提取23-24
• 2.2.4 硅藻DNA純度檢測24-25
• 2.2.5 PCR擴增25
• 2.2.6 瓊脂糖凝膠電泳25-26
• 2.2.7 PCR產(chǎn)物測序26
• 2.3 結(jié)果26-27
• 2.3.1 硅藻DNA純度26
• 2.3.2 硅藻及其對照樣本擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果26-27
• 2.3.3 PCR產(chǎn)物測序結(jié)果27
• 2.3.4 實驗動物器官檢出率結(jié)果27
• 2.4 討論27-29
• 第三章 PCR-CE法檢測硅藻SSU基因29-40
• 3.1 材料30-31
• 3.1.1 主要儀器30
• 3.1.2 主要試劑及耗材30-31
• 3.1.3 樣本來源31
• 3.2 方法31-34
• 3.2.1 組織中硅藻分離方法31
• 3.2.2 水樣硅藻分離方法31
• 3.2.3 硅藻DNA提取31-33
• 3.2.4 PCR擴增33
• 3.2.5 毛細(xì)管電泳33-34
• 3.2.6 微波消解-掃描電鏡法檢驗硅藻34
• 3.3 結(jié)果34-39
• 3.4 討論39-40
• 第四章 PCR-DHPLC法檢測硅藻SSU基因40-51
• 4.1 材料42-43
• 4.1.1 主要儀器42
• 4.1.2 主要試劑及耗材42-43
• 4.1.3 樣本來源43
• 4.2 方法43-47
• 4.2.1 組織中硅藻分離方法43
• 4.2.2 水樣硅藻分離方法43
• 4.2.3 硅藻DNA提取43-45
• 4.2.4 PCR擴增45
• 4.2.5 DHPLC溫度預(yù)測45
• 4.2.6 配制DHPLC緩沖液45
• 4.2.7 DHPLC儀操作流程45-46
• 4.2.8 DHPLC異常峰型分析46-47
• 4.2.9 微波消解-掃描電鏡法檢驗硅藻47
• 4.3 結(jié)果47-49
• 4.3.1 DHPLC結(jié)果47-48
• 4.3.2 DHPLC法與微波消解-掃描電鏡法硅藻檢出結(jié)果比較48-49
• 4.4 討論49-51
• 全文小結(jié)51
• 存在的問題和展望51-53
• 參考文獻53-58
• 附錄58-68
• 研究生期間研究成果68-69
• 致謝69-70

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前9條

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本文編號：953663