本文關(guān)鍵詞：基因區(qū)與基因間區(qū)五條靶序列DNA甲基化在甄別同卵雙生個(gè)體中的研究

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【摘要】：目的：由于同卵雙胞胎（monozygotic twins, MZ）是由同一個(gè)受精卵發(fā)育而來(lái)，擁有相同或高度相似的DNA序列，采用目前使用的個(gè)體識(shí)別技術(shù)，如短串聯(lián)重復(fù)（short tandem repeat, STR）分型技術(shù)、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymophism, SNP）分型技術(shù)，mtDNA分型技術(shù)等，均不能對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，這給涉及MZ的案件偵破帶來(lái)極大困難和阻力。表觀遺傳學(xué)是研究不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控的可遺傳修飾，其中DNA甲基化是最主要的一種表觀遺傳修飾。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)MZ個(gè)體的DNA甲基化存在差異，且本課題前期通過對(duì)1對(duì)新生兒MZ的全基因組甲基化譜的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在基因區(qū)和基因間區(qū)共有2205條DNA甲基化差異序列，并篩選出113條序列作為后續(xù)分析的候選位點(diǎn)。 本研究將從中進(jìn)一步篩選一些序列，利用焦磷酸測(cè)序測(cè)序技術(shù)對(duì)大樣本雙生子進(jìn)行DNA甲基化定量分析，探討各序列甲基化能否鑒別MZ，評(píng)估其鑒別能力，并比較基因區(qū)和基因間區(qū)DNA甲基化鑒別MZ能力的大小，旨在為從遺傳學(xué)角度解決鑒別MZ不同個(gè)體的難題提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為建立可行的解決方案提供有價(jià)值的參考。 方法：應(yīng)用Qiagen公司的QIAamp DNABlood kit提取血液樣本的DNA,應(yīng)用漱口水提取試劑盒（泰州泰朗生物科技服務(wù)有限公司）提取漱口水的全基因組DNA。利用Goldeneye DNA身份鑒定系統(tǒng)的BASIC試劑盒檢測(cè)雙生子DNA樣本的STR分型，以明確每對(duì)雙生子樣本的同異卵情況。應(yīng)用ZYMO公司的EZ DNA Methylation-Gold Kit對(duì)基因組DNA進(jìn)行重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后的DNA做為模板，分別擴(kuò)增GS1、 GS2、GS3、IGS1、IGS2五條靶序列。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行單鏈純化，然后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，獲得五條序列20個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化水平的定量數(shù)據(jù)。應(yīng)用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)、pearson相關(guān)分析、t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)等方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 結(jié)果： 15條靶序列的特征 GS1(Genebank Accesion number: XM_006726188)位于跨膜通道樣蛋白4（transmembrane channel-like4，TMC4）的外顯子區(qū)，擴(kuò)增片段為85bp，可檢測(cè)6個(gè)CpG位點(diǎn)；GS2(Genebank Accesion number: NM_001159387)位于beta-1,4-N-acetyl-galactosaminyl transferase2(B4GALNT2)的外顯子區(qū)，擴(kuò)增片段為105bp，可檢測(cè)2個(gè)CpG位點(diǎn)；GS3(Genebank Accesionnumber: NM_001256358)位于酪氨酸蛋白激酶6（protein tyrosine kinase6,PTK6)的外顯子區(qū)，擴(kuò)增片段為129bp，可檢測(cè)5個(gè)CpG位點(diǎn)。 IGS1和IGS2均位于3號(hào)染色體(Genebank Accesion number:NC_000003.12)的基因間區(qū)，IGS1擴(kuò)增片段為139bp，可檢測(cè)4個(gè)CpG位點(diǎn)； IGS2擴(kuò)增片段為164bp，可檢測(cè)3個(gè)CpG位點(diǎn)。 25條靶序列的平均DNA甲基化水平及組織差異性分析 在所調(diào)查的352個(gè)血液樣本中，GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列的平均甲基化水平為88%、89%、92%、85%、82%。 血液樣本中GS1、GS3序列11個(gè)CpG位點(diǎn)的平均甲基化水平分別為92%、83%、74%、97%、93%、89%、93%、98%、90%、90%、89%，但在126個(gè)漱口水樣本中的平均甲基化水平分別為66%、65%、57%、68%、66%、62%、89%、96%、86%、87%、88%明顯低于血液樣本。其中102名個(gè)體同時(shí)包括血液樣本和漱口水樣本，對(duì)該102名個(gè)體血液與漱口水樣本的甲基化水平進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)GS1序列和GS3序列DNA甲基化水平在同一個(gè)體漱口水與血液樣本中也存在明顯差異，血液的甲基化程度顯著高于漱口水的甲基化程度。 相關(guān)系數(shù)矩陣顯示，在每一個(gè)序列內(nèi)部，各CpG位點(diǎn)之間甲基化程度的表現(xiàn)為一定的相關(guān)性。 3雙生子之間甲基化差異分析 以焦磷酸測(cè)序儀靈敏度5%為標(biāo)準(zhǔn)，我們?cè)O(shè)定，若雙生子之間甲基化水平差值大于5%，則被認(rèn)為有差異，小于或等于5%的視為無(wú)差異。 3.1血液樣本各序列雙生子間差異分析 GS1、GS2、GS3、IGS1、IGS2序列MZ之間甲基化水平有差異的分別有38對(duì)、0對(duì)、18對(duì)、31對(duì)、57對(duì)，DZ之間甲基化水平有差異的分別有21對(duì)、0對(duì)、5對(duì)、23對(duì)、12對(duì)。5條序列累積能夠區(qū)分93對(duì)MZ和39對(duì)DZ，分別占MZ及DZ總樣本量的77.50%及67.24%，表明在血液樣本中5條序列20個(gè)CpG位點(diǎn)區(qū)分MZ的累積鑒別能力為77.50%，，區(qū)分DZ的累積鑒別能力為67.24%。 對(duì)各序列鑒別MZ與DZ的能力進(jìn)行χ2檢驗(yàn)比較分析，發(fā)現(xiàn)基因區(qū)GS1及GS3鑒別MZ與DZ的能力無(wú)差異，二個(gè)序列聯(lián)合起來(lái)計(jì)算，鑒別MZ與DZ的能力也無(wú)明顯差異；但基因間區(qū)IGS1鑒別MZ能力小于DZ，IGS2鑒別MZ的能力大于DZ，二者聯(lián)合起來(lái)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 此外，我們分析了基因區(qū)和基因間區(qū)序列鑒別MZ能力是否存在差異。結(jié)果顯示，基因區(qū)的3條序列13個(gè)CpG位點(diǎn)能夠區(qū)分50對(duì)MZ及23對(duì)DZ，分別占MZ及DZ總樣本量的41.67%及39.66%。而基因間區(qū)2條序列7個(gè)CpG位點(diǎn)能夠區(qū)分73對(duì)MZ及29對(duì)DZ，分別占MZ及DZ總樣本量的60.83%及50.00%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，基因間區(qū)序列鑒別MZ的能力明顯高于基因區(qū)序列。 3.2漱口水樣本各序列雙生子間差異分析 漱口水樣本GS1、GS3序列MZ之間甲基化水平有差異的分別有40對(duì)、15對(duì)，DZ之間甲基化水平有差異的分別有10對(duì)、1對(duì)。2條序列累積能夠區(qū)分42對(duì)MZ和10對(duì)DZ，分別占MZ及DZ總樣本量的84.00%及76.92%，表明在漱口水樣本中2條序列11個(gè)CpG位點(diǎn)區(qū)分MZ的累積鑒別能力84.00%，區(qū)分DZ的累積鑒別能力為76.92%。經(jīng)χ2檢驗(yàn)，漱口水樣本的鑒別能力明顯高于對(duì)應(yīng)序列血液樣本的鑒別能力。 3.3雙生子之間甲基化差別與年齡的相關(guān)性分析 為探討雙生子間甲基化的差別是否隨年齡增加而增大，我們分析了二者之間的相關(guān)性。結(jié)果表明，IGS1序列、IGS2序列在MZ之間的DNA甲基化差異與年齡呈較弱的負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.276、-0.229，表現(xiàn)為，隨著年齡增大，MZ之間的甲基化差異呈現(xiàn)減小的趨勢(shì)。其余序列甲基化在MZ之間的差異與年齡均無(wú)明顯相關(guān)性。 4年齡、性別、民族、吸煙與甲基化的相關(guān)性 4.1年齡對(duì)5條靶序列甲基化的影響 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果表明，血液樣本中GS1、GS3、IGS1、IGS2四條靶序列及漱口水樣本中GS3序列的甲基化程度均與年齡呈弱相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.223、-0.214、-0.376、-0.202及0.241。 我們按照10歲的年齡段將樣本分為5個(gè)年齡組：0-10歲、11-20歲、21-30歲、31-40歲、41-50歲及50歲。比較各年齡組間甲基化程度的差異，發(fā)現(xiàn)血液樣本的所有5條靶序列各年齡組間甲基化程度存在顯著差異，漱口水樣本GS3序列甲基化程度在各年齡組間存在差異，只有漱口水樣本GS1序列甲基化水平在各年齡組無(wú)顯著差異。差異主要表現(xiàn)在低年齡組（0-10歲組）與高年齡組（31-40、41-50、＞50歲組）間。 4.2性別對(duì)5條靶序列甲基化的影響 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果表明，性別因素與血液樣本中5條靶序列及漱口水樣本中2條靶序列的甲基化程度均無(wú)明顯相關(guān)性。不同性別間的甲基化水平比較結(jié)果也表明，在所檢測(cè)的所有序列中，甲基化程度在不同性別之間無(wú)顯著差異。 4.3民族對(duì)5條靶序列甲基化的影響 樣本志愿者來(lái)自六個(gè)民族：漢族、哈尼族、拉祜族、壯族、回族及彝族，因后四個(gè)民族樣本較少，合并為一組。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果表明，只有血液樣本中GS2序列甲基化程度與民族具有較弱的相關(guān)性，r=0.243，其余各序列甲基化程度均與民族無(wú)明顯相關(guān)性。在血液樣本GS1序列的CpG3位點(diǎn)、GS2序列的CpG1位點(diǎn)、GS3序列的CpG5位點(diǎn)，漢族與其他民族甲基化水平有差異。GS2序列的CpGmean漢族與其他民族甲基化水平也表現(xiàn)出顯著差異。 4.4吸煙對(duì)5條靶序列甲基化的影響 Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果表明，只有血液樣本GS3序列甲基化程度與吸煙呈弱相關(guān)，其余序列甲基化程度均與吸煙無(wú)顯著相關(guān)性。血液樣本GS3序列的CpG5、IGS1序列的CpG2位點(diǎn)、IGS2序列的CpG1位點(diǎn)，吸煙與不吸煙者甲基化水平有明顯差異，GS3序列的CpGmean吸煙與不吸煙者甲基化水平也表現(xiàn)出顯著差異。漱口水樣本GS3序列的CpG4位點(diǎn)吸煙與不吸煙者也存在顯著差異。 結(jié)論: 1）本研究選用的5條靶序列DNA甲基化鑒別MZ的累積效能為77.5%，除GS2外，其余4條靶序列均有一定的鑒別能力，可作為候選序列�；蜷g區(qū)兩條序列鑒別MZ能力明顯高于基因區(qū)的三條序列，提示我們盡量選擇基因間區(qū)序列作為候選序列，以提高甄別效能。同一序列漱口水樣本鑒別MZ能力高于血液樣本，說明漱口水樣本的甲基化差異程度大于血液樣本，甄別MZ的價(jià)值優(yōu)于血液樣本�；蜷g區(qū)兩條序列DNA甲基化在MZ雙生子個(gè)體間的差異程度隨年齡增加呈現(xiàn)較弱的下降趨勢(shì)，原因有待進(jìn)一步研究。 2）5條靶序列中除GS2外的DNA甲基化程度均與年齡呈一定的相關(guān)性，且不同年齡組間存在顯著差異，表明年齡是影響DNA甲基化的一個(gè)重要因素。5條序列中，只有GS2(B4GALNT2)的外顯子甲基化與民族具有相關(guān)性，漢族與哈尼族和其他民族DNA甲基化表現(xiàn)出明顯差異，表明該基因在不同民族間的甲基化程度不同，可能成為種族鑒別的遺傳標(biāo)記。5條序列中，只有GS3(PTK6)的外顯子甲基化與吸煙有關(guān)，表明吸煙可能影響該基因的甲基化修飾及表達(dá)調(diào)控。 3）GS1和GS3兩條序列DNA甲基化表現(xiàn)出明顯的組織差異性，血液樣本的甲基化程度明顯高于漱口水樣本，提示我們?cè)趯?shí)際應(yīng)用中，一定要采樣相同的組織樣本進(jìn)行比對(duì)。
【關(guān)鍵詞】：同卵雙生子 DNA甲基化 基因區(qū)序列 基因間區(qū)序列 重亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化 焦磷酸測(cè)序
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：D919.4
【目錄】：

• 摘要4-9
• ABSTRACT9-16
• 英文縮寫16-17
• 前言17-18
• 材料與方法18-23
• 結(jié)果23-28
• 附圖28-48
• 附表48-55
• 討論55-60
• 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 綜述 法醫(yī) DNA 甲基化分型：機(jī)遇與挑戰(zhàn)64-83
• 參考文獻(xiàn)75-83
• 致謝83-84
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷84

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前4條

1 尹慧;黃代新;翟仙敦;楊慶恩;;HPLC法檢測(cè)人外周血5-~mC含量及其與年齡相關(guān)性研究[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2007年01期

2 趙書民;李成濤;;DNA甲基化在法醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景及其檢測(cè)方法新進(jìn)展[J];法醫(yī)學(xué)雜志;2009年04期

3 李淑瑾;關(guān)亞卿;張賀玲;付麗紅;張曉靜;馬春玲;叢斌;;1對(duì)同卵雙生新生兒DNA甲基化譜差異分析[J];中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志;2012年04期

4 李春宏;張志勇;;DNA甲基化與衰老研究進(jìn)展[J];中華疾病控制雜志;2008年04期

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 徐潔;LINE-1 DNA甲基化：鑒別同卵雙生個(gè)體的潛在遺傳標(biāo)記[D];河北醫(yī)科大學(xué);2013年

本文編號(hào)：596243