本文選題：法醫(yī)分子毒理學(xué) + 烏頭堿��； 參考：《華中科技大學(xué)》2009年博士論文

【摘要】： 1研究背景 有毒動(dòng)植物中毒是具有中國特色法醫(yī)毒理學(xué)的重要組成部分，也是我國法醫(yī)毒理學(xué)研究的重點(diǎn)內(nèi)容之一。烏頭與烏頭屬植物是我國臨床常用的重要中藥，是藥用有毒植物的典型代表，也為我國最早有記載的有毒植物，其主要毒性成分為烏頭類生物堿，其中以含有雙酯基化學(xué)結(jié)構(gòu)的烏頭堿毒性最強(qiáng)。烏頭堿的主要毒性作用的靶器官，主要為心臟與神經(jīng)系統(tǒng)。有大量研究表明，烏頭堿的毒性成份，也是其藥性成份，具有強(qiáng)心、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤、降低血壓、降低血管通透性等作用，廣泛地被應(yīng)用于臨床治療。由于烏頭堿的毒性劇烈，其有效治療劑量與中毒劑量或致死量極為接近，用藥稍有不慎，如因炮制不當(dāng)，或誤服等，即可引起中毒甚至死亡。而利用烏頭屬植物及烏頭堿自殺、投毒他殺的案件時(shí)有發(fā)生，可見烏頭堿中毒在有毒動(dòng)植物中毒中占有重要位置。 為了進(jìn)一步提高烏頭堿中毒的診斷、治療，規(guī)范烏頭屬有毒中藥在疾病中的使用，，同時(shí)，也為烏頭堿中毒的法醫(yī)學(xué)鑒定提供相關(guān)的理論依據(jù)，對(duì)烏頭堿中毒機(jī)制研究，特別是烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞的毒性作用機(jī)制研究，成為了中藥研究與應(yīng)用、臨床急救醫(yī)學(xué)和法醫(yī)毒理學(xué)研究的重點(diǎn)問題。 近年來，國內(nèi)外對(duì)烏頭堿心肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制的研究，已進(jìn)入到細(xì)胞質(zhì)膜動(dòng)態(tài)變化的分子作用機(jī)理水平。但大多仍局限于心肌細(xì)胞損傷及單個(gè)心肌細(xì)胞離子通道檢測(cè)等方面，對(duì)毒物靶器官心室肌細(xì)胞群毒性作用的分子毒理學(xué)機(jī)制，特別是烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞之間信息傳遞的影響機(jī)制、基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制尚不明確。 2研究目的 2．1系統(tǒng)觀察不同濃度烏頭堿染毒后心肌細(xì)胞的毒理病理學(xué)變化，研究不同中毒劑量、中毒時(shí)間與病變間的效應(yīng)關(guān)系，優(yōu)化、規(guī)范烏頭堿靶器官的細(xì)胞培養(yǎng)及分子毒理學(xué)研究的基礎(chǔ)方法； 2．2研究烏頭堿中毒與心肌細(xì)胞DNA損傷的關(guān)系，為從分子毒理學(xué)角度研究DNA損傷與烏頭堿中毒機(jī)制的關(guān)系提供基礎(chǔ)； 2．3研究烏頭堿染毒對(duì)心肌細(xì)胞Ca~(2+)依賴性蛋白激酶Cα亞型(PKCα)的表達(dá)、PKCα磷酸化水平，以及PKCα磷酸化對(duì)Cx43磷酸化表達(dá)的影響，明確其內(nèi)在級(jí)聯(lián)效應(yīng)關(guān)系，及參與烏頭堿心肌細(xì)胞毒性作用分子機(jī)制的途徑； 2．4研究烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca~(2+)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響，觀察Ca~(2+)調(diào)控蛋白參與烏頭堿心肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制的方式； 2．5研究烏頭堿中毒特征及法醫(yī)學(xué)鑒定注意事項(xiàng)。 3研究方法 3．1新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)及其方法優(yōu)化研究 選擇1～2d的SD新生大白鼠，雄雌不限，消毒后直接剪取心室肌，用胰蛋白酶等消化液消化，制作心肌細(xì)胞懸液；于37℃、5％CO_2培養(yǎng)箱，以差速貼壁法培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞，優(yōu)化心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法，提高心室肌細(xì)胞純度、成活率和心肌細(xì)胞群整體性。選用臺(tái)盼藍(lán)染色法進(jìn)行培養(yǎng)心肌細(xì)胞活性鑒定；采用抗心肌特異性單克隆抗體，結(jié)合間接免疫熒光法檢測(cè)，對(duì)心肌細(xì)胞純度進(jìn)行鑒定。規(guī)范、優(yōu)化新生大鼠心肌細(xì)胞體外原代培養(yǎng)的方法，為后續(xù)研究建立良好地基礎(chǔ)。 3．2烏頭堿染毒模型的建立及毒性效應(yīng)研究 于心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)第6天，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)16～18h，以去除血清干擾，再加入不同濃度烏頭堿，構(gòu)建心肌細(xì)胞烏頭堿染毒模型，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌�，設(shè)定不同的陽性和陰性對(duì)照。實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)烏頭堿染毒心肌細(xì)胞的形態(tài)、功能的變化，研究烏頭堿的毒性對(duì)心肌細(xì)胞損傷的量效作用。 3．3烏頭堿對(duì)大鼠心肌培養(yǎng)細(xì)胞DNA損傷的研究 新生SD大鼠24只，隨機(jī)分為6組；取心室肌以差速貼壁法原代培養(yǎng)心室肌細(xì)胞。培養(yǎng)第6天，更換無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)后，制成密度為2×10~5個(gè)細(xì)胞／mL的細(xì)胞懸液，分別加入濃度為0.1、0.5、1.0、2.0μmol／L的烏頭堿混合液，染毒30 min；并以PBS溶液作陰性對(duì)照。采用彗星電泳技術(shù)及CASP分析軟件，檢測(cè)不同濃度烏頭堿染毒后心室肌細(xì)胞DNA損傷程度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 3．4烏頭堿對(duì)新生大鼠心肌培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)PKCα表達(dá)的影響 取12孔原代心肌培養(yǎng)細(xì)胞組，分成對(duì)照組(Normal)、烏頭堿染毒組(ACO)、堿性磷酸酶處理組(A．P．)、AAP干預(yù)組(AAP)、AAP干預(yù)后烏頭堿染毒組(AAP+ACO)、PKCα抑制劑G(o|¨) 6976干預(yù)組(G(o|¨) 6976)，及AAP與G(o|¨) 6976聯(lián)合干預(yù)組(AAP+G(o|¨) 6976)，共7組。提取各實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組心肌細(xì)胞總蛋白，以BCA法標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線定量，采用Western-blotting技術(shù)，選用P-Cx43(Ser-368)蛋白抗體、NP-Cx43(Ser-368)蛋白抗體、抗PKCα蛋白抗體，及P-PKCα(Ser-657)蛋白抗體，定量檢測(cè)各組在培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)P-Cx43(Ser-368)蛋白、NP-Cx43(Ser-368)蛋白、總PKCα蛋白，及P-PKCα(Ser-657)蛋白表達(dá)含量變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 3．5烏頭堿對(duì)心肌細(xì)胞PKCα及P-PKCα(Ser-657)位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)的影響 選擇兔抗鼠總PKCα多克隆抗體(稀釋度為1：200)、兔抗鼠磷酸化PKCα(Ser-657)(稀釋度為1：200)功能性抗體，用Fluorescein標(biāo)記山羊抗兔IgG和Rhodamine標(biāo)記山羊抗兔IgG(稀釋度為1：100)，應(yīng)用激光共聚焦掃描顯微鏡，結(jié)合細(xì)胞圖像熒光定分析技術(shù)，檢測(cè)烏頭堿染毒前后，心肌細(xì)胞激酶Cα亞型及其第657位絲氨酸殘基(Ser657)位點(diǎn)，特異性磷酸化狀態(tài)的改變。 3．6烏頭堿對(duì)大鼠心肌培養(yǎng)細(xì)胞Ca~(2+)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響 取12孔原代心肌培養(yǎng)細(xì)胞組，運(yùn)用熒光標(biāo)記技術(shù)及RT-PCR技術(shù)，建立鈉鈣交換體(NCX)、肌漿網(wǎng)鈣泵Ca~(2+)-ATP酶(SERCA_2)、磷酸受鈉蛋白(PLB)、蘭尼堿受體(RyR_2)，及管家基因β-actin共5個(gè)基因座的多重?zé)晒鈴?fù)合RT-PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增方法，在3100 DNA測(cè)序儀中進(jìn)行毛細(xì)管電泳，檢測(cè)烏頭堿染毒組及正常對(duì)照組心肌細(xì)胞內(nèi)NCX、SERCA_2、RyR_2、PLB四種基因mRNA表達(dá)的差異與變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。 3．7烏頭堿中毒10例法醫(yī)學(xué)尸檢資料分析 收集10例烏頭堿中毒死亡的法醫(yī)學(xué)鑒定資料，包括系統(tǒng)的法醫(yī)學(xué)解剖資料及組織病理學(xué)檢查結(jié)果，部分案例還有案情調(diào)查、搶救病歷資料等；并按年齡、性別、中毒原因、中毒類型、病理變化及特征等分類整理。結(jié)烏頭堿中毒的毒理病理組織學(xué)變化，探討烏頭堿中毒法醫(yī)學(xué)鑒定的注意事項(xiàng)。 3．8實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)研究采用SSPS統(tǒng)計(jì)軟件(version 10.0，USA)分析，數(shù)據(jù)以(?)±s表示。 3．8．1彗星電泳結(jié)果采用CASP軟件分析HDNA％、TDNA％、TL、TM、OTM，5個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。計(jì)算各組平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，以(?)±s表示，應(yīng)用SSPS在方差齊性條件下做單因素方差分析，對(duì)各劑量組組間差異進(jìn)行比較分析。 3．8．2正常對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組中P-Cx43(Ser-368)蛋白表達(dá)和NP-Cx43(Ser-368)蛋白表達(dá)差異、總PKCα蛋白表達(dá)和P-PKCα(Ser-657)蛋白表達(dá)相對(duì)含量分析，應(yīng)用SSPS做單變量兩因素方差分析(ANOVA)，對(duì)組間均數(shù)的多重比較選用Games-Howell檢驗(yàn)。 3．8．3對(duì)ca~(2+)調(diào)控蛋白NCX、SERCA_2、RyR_2、PLB基因mRNA表達(dá)的差異與變化，應(yīng)用SSPS做t檢驗(yàn)。 4研究結(jié)果 4．1原代培養(yǎng)心肌細(xì)胞及其方法優(yōu)化 在倒置相差顯微鏡下觀察，剛接種時(shí)的心肌細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，為均一、分散的圓形折光顆粒；12 h后細(xì)胞已開始貼壁生長，偶爾可見個(gè)別細(xì)胞自發(fā)搏動(dòng)；培養(yǎng)24 h后，貼壁細(xì)胞互相連接呈稀疏網(wǎng)狀，并出現(xiàn)緩慢的同步化搏動(dòng)；48 h后，心肌細(xì)胞在培養(yǎng)孔底部進(jìn)一步伸展，呈現(xiàn)快速同步化搏動(dòng)的細(xì)胞單層，搏動(dòng)頻率約80～120次／min；培養(yǎng)第6天，心肌細(xì)胞在培養(yǎng)孔底部充分伸展，形成穩(wěn)定的同步化搏動(dòng)細(xì)胞單層，頻率約120次／min。采用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定，活細(xì)胞的存活率平均達(dá)到97.33％；選用抗心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTnⅠ)特異性單克隆抗體，結(jié)合免疫熒光法檢測(cè)，心肌培養(yǎng)細(xì)胞平均細(xì)胞純度為97.1％。 4．2烏頭堿對(duì)心肌培養(yǎng)細(xì)胞染毒模型的建立及毒性效應(yīng)觀察 建立烏頭堿染毒模型，與正常對(duì)照組比較，不同劑量烏頭堿染毒后，心肌細(xì)胞出現(xiàn)非同步性搏動(dòng)，搏動(dòng)減慢，甚至停博。心肌細(xì)胞烏頭堿染毒后，毒理病理變化與中毒劑量、中毒時(shí)間呈現(xiàn)一定的相關(guān)性。 4．3烏頭堿對(duì)大鼠心肌培養(yǎng)細(xì)胞DNA損傷的觀察 心肌培養(yǎng)細(xì)胞被不同濃度烏頭堿染毒后，尾部DNA含量、彗尾長度、尾矩、Olive-尾矩均隨烏頭堿濃度增加而升高，頭部DNA含量則逐漸降低，與對(duì)照組相比，均有極顯著性差異(P＜0.01)；結(jié)果顯示，烏頭堿染毒劑量越大，心肌細(xì)胞DNA損傷越嚴(yán)重。 4．4烏頭堿對(duì)心肌培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)PKCα蛋白表達(dá)的影響 4．4．1對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)P-Cx43(Ser-368)表達(dá)的觀察 各實(shí)驗(yàn)組均以Normal為參照。不同干預(yù)組對(duì)P-Cx43(Ser-368)蛋白表達(dá)均有所不同。與正常對(duì)照組比較，ACO、A．P．、G(o|¨) 6976組心肌細(xì)細(xì)胞P-Cx43(Ser-368)蛋白表達(dá)均下降；AAP、AAP+ACO、AAP+G(o|¨)9676組P-Cx43(Ser-368)蛋白表達(dá)均上升。選用Games-Howell統(tǒng)計(jì)方法，檢驗(yàn)多組間均數(shù)的多重比較，顯示ACO、A．P．、G(o|¨) 6976三組間，僅ACO染毒組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；而AAP、AAP+ACO、AAP+G(o|¨)9676三個(gè)干預(yù)組之間未見明顯差異。從Western Blotting檢測(cè)結(jié)果顯示：ACO、A．P．、G(o|¨) 6976干預(yù)后，Cx43(Ser-368)位點(diǎn)磷酸化蛋白表達(dá)減少；經(jīng)APP預(yù)處理后，磷酸化表達(dá)增強(qiáng)，且效果明顯(P＜0.01)。 4．4．2對(duì)心肌細(xì)胞內(nèi)NP-Cx43(Ser-368)表達(dá)的觀察 各組NP-Cx43(Ser-368)位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)蛋白定量分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照比較，A．P．組、ACO染毒組、G(o|¨) 6976組表達(dá)增強(qiáng)(P＜0.01)，其中A．P．組表達(dá)最強(qiáng)。而AAP組、AAP+ACO組、AAP+G(o|¨) 6976聯(lián)用組則表達(dá)降低(P＜0.01)。 4．4．3對(duì)心肌細(xì)胞中總PKCα表達(dá)的觀察 各組總PKCα蛋白定量分析結(jié)果顯示：與正常對(duì)照比較，A．P．組、ACO染毒組、G(o|¨) 6976組、AAP組、AAP+ACO組、AAP+G(o|¨) 6976聯(lián)用組心肌細(xì)胞內(nèi)總PKCα表達(dá)水平無顯著差異(P＞0.05)。 4．4．4對(duì)心肌細(xì)胞中總P-PKCα(Ser-657)表達(dá)的觀察 各實(shí)驗(yàn)組均以Normal為參照。不同實(shí)驗(yàn)干預(yù)組P-PKCα(Ser-657)蛋白均有不同程度的表達(dá)。正常組和ACO組心肌細(xì)胞內(nèi)均有P-PKCα(Ser-657)蛋白表達(dá)，而A．P．組心肌細(xì)胞內(nèi)無P-PKCα(Ser-657)蛋白表達(dá)。 與正常對(duì)照組相比較，ACO組、G(o|¨) 6976組心肌細(xì)胞中P—PKCα(Ser-657)磷酸化蛋白表達(dá)顯著降低(P＜0.01)。而AAP組、AAP+ACO組、AAP+G(o|¨) 6976聯(lián)合處理組，磷酸化表達(dá)增強(qiáng)，心肌細(xì)胞P-PKCα(Ser-657)蛋白表達(dá)顯著增高(P＜0.01)。 4．4．5烏頭堿染毒前后心肌細(xì)胞PKCα及PKCα(Ser-657)位點(diǎn)磷酸化狀態(tài)的觀察應(yīng)用激光掃描共聚焦顯微鏡，觀察免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示： 標(biāo)記總PKCα的Fluorescein呈綠色熒光信號(hào)，彌散性分布于心肌細(xì)胞胞漿中。與正常對(duì)照組相比較，ACO染毒組、G(o|¨) 6976組、AAP組、AAP+ACO組、AAP+G(o|¨) 6976聯(lián)合處理組總PKCα綠色熒光信號(hào)差異無顯著性。 標(biāo)記P-PKCα(Ser-657)的Rhodamine呈紅色熒光信號(hào)，彌散性分布于心肌細(xì)胞胞漿中。與正常對(duì)照組相比較，ACO染毒組、G(o|¨) 6976組，紅色熒光信號(hào)顯著減弱，有極顯著性差異(P＜0.01)；而AAP組、AAP+ACO組、AAP+G(o|¨) 6976聯(lián)合處理組紅色熒光信號(hào)較正常對(duì)照組，也有極顯著性差異(P＜0.01)。 4．5烏頭堿對(duì)大鼠心肌培養(yǎng)細(xì)胞Ca~(2+)調(diào)控蛋白表達(dá)的影響 多重?zé)晒鈴?fù)合RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組比較，烏頭堿染毒組RyR_2、NCX基因mRNA表達(dá)增加，而PLB、SERCA_2基因mRNA表達(dá)減少。 4．6烏頭堿中毒尸檢資料分析 病理變化特征主要為： ①心肌灶性出血，細(xì)胞橫紋不清，肌漿凝聚，細(xì)胞間質(zhì)淤血； ②肝可見肝細(xì)胞灶性或點(diǎn)狀壞死，可見肝細(xì)胞脂肪變性或水樣變性； ③肺臟可有灶性或點(diǎn)狀出血，灶性肺水腫； ④可見部分胃粘膜有散在性點(diǎn)狀出血； ⑤偶見腎組織點(diǎn)狀出血和散在性壞死。 5研究結(jié)論 5．1優(yōu)化、規(guī)范心肌細(xì)胞培養(yǎng)方法，建立穩(wěn)定的體外新生大鼠培養(yǎng)細(xì)胞的烏頭堿染毒模式，為法醫(yī)毒理學(xué)研究提供了方法學(xué)上的參考。 5．2烏頭堿染毒可引起心肌細(xì)胞DNA損傷，并呈明顯的劑量—效應(yīng)關(guān)系，推測(cè)細(xì)胞DNA損傷參與烏頭堿毒性作用機(jī)制。 5．3烏頭堿染毒可影響PKCα本身的磷酸化狀態(tài)，同時(shí)烏頭堿染毒所致的PKCα(Ser657)位點(diǎn)蛋白磷酸化表達(dá)下降，可進(jìn)一步導(dǎo)致心肌細(xì)胞Cx43磷酸化狀態(tài)減弱。推測(cè)PKCα磷酸化、Cx43磷酸化狀態(tài)的改變是烏頭堿心肌細(xì)胞毒性作用機(jī)制之一。 5．4烏頭堿可影響心肌細(xì)胞Ca~(2+)調(diào)控蛋白的表達(dá)，使RyR_2、NCX基因mRNA表達(dá)增加，PLB、SERCA_2基因mRNA表達(dá)減少，推測(cè)Ca~(2+)調(diào)控蛋白參與了烏頭堿毒性作用機(jī)制。其毒性作用機(jī)制的方式仍有待進(jìn)一步研究。。Ca~(2+)調(diào)控蛋白參與毒性作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 5．5對(duì)10例烏頭堿中毒尸檢資料進(jìn)行分析，總結(jié)其毒理病理變化特點(diǎn)，并提出烏頭堿中毒法醫(yī)學(xué)鑒定的注意事項(xiàng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：D919

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王慧玉;孫暉;陸欣;董輝;王喜軍;;烏頭屬中藥成分的構(gòu)效關(guān)系研究進(jìn)展[J];世界科學(xué)技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化);2011年06期

2 姜允申;莫寶慶;;靶器官腫瘤毒理學(xué)介紹[J];中國職業(yè)醫(yī)學(xué);2012年01期

本文編號(hào)：1919010