本文關鍵詞：運用RNA降解規(guī)律構建數學模型推斷死亡時間

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【摘要】：死亡時間(postmortem interval,PMI)是指發(fā)現、檢查尸體時距死亡發(fā)生時的時間間隔。PMI的準確推斷具有重要的法醫(yī)學實踐價值,一直是法醫(yī)學病理學研究的重點和難點。利用傳統(tǒng)的方法進行死亡時間的推斷一直受到各種因素的制約,如環(huán)境溫度,死亡原因等,導致推斷的準確性和精確性較低。隨著分子生物學技術在法醫(yī)學領域的廣泛應用,利用生物體內RNA的時間依賴性降解規(guī)律推斷死亡時間正逐漸成為目前研究的熱點。實時定量PCR(quantitative real time PCR, qRT-PCR)作為RNA表達量的精確定量技術,具有準確高效的優(yōu)點,被越來越多的應用于PMI的推斷,但其結果必須依賴于穩(wěn)定內參指標的標準化,目前構建的推斷PMI模型相對單一,通常只考慮單個因素的影響,而忽略多組織、多溫度和多死因的探討,實際應用受限。本實驗利用實時定量PCR技術,檢測已知明確死亡時間的人體組織和動物模型組織中(心肌、肝臟和皮膚)多個RNA指標的表達量,以期發(fā)現受各因素影響較小的RNA指標作為標準化的內參指標。在此基礎上,針對大鼠組織內特定RNA指標進行死后不同時間的規(guī)律性研究,綜合多個分子指標構建多組織、多溫度組的數學模型用以推斷死亡時間；將明確死亡時間的大鼠樣本和人體資料代入方程進行驗證,探討環(huán)境溫度及死亡原因等因素對死亡時間推斷的影響程度,以期為人體死亡時間的精確推斷提供新的方法與理論基礎。此外,本研究也通過構建不同死因的大鼠模型,檢測心肌多種RNA指標在死后不同時間點的表達變化情況,以期為不同死因下的死亡時間推斷提供一種新的思路。研究目的1.通過實時定量PCR技術對人體組織及大鼠組織中各RNA指標的轉錄水平進行檢測,旨在尋找出穩(wěn)定通用的內參標志物用以精確的推斷死亡時間。2.設置四個連續(xù)的溫度組,明確斷頸死大鼠三種組織中各RNA死后降解規(guī)律與死亡時間的相互關系,利用標準化的qRT-PCR數據構建多參數數學模型推測死亡時間。利用已知死亡時間的大鼠樣本和人體樣本進行數學模型的驗證,統(tǒng)計推斷死亡時間和真實死亡時間之間的誤差率,明確環(huán)境溫度及死亡原因等因素對死亡時間推斷的影響。3.構建斷頸死、窒息死和失血性休克三種大鼠死亡模型,明確不同死亡原因下大鼠心肌內多種RNA表達量隨隨死亡時間的降解規(guī)律,以期為不同死因下死亡時間的推斷提供參考。方法和結果第一部分1.委托上海市公安局刑事科學技術研究所收集79例人體案例樣本組織,每例尸體都準確的記錄死亡時間、溫度、死因等。每例尸體均取心肌、肝臟和皮膚組織分裝于RNAlater保護液,置于-80℃凍存、備用。2.斷頸處死288只SD大鼠用以構建模型,尸體立即放置于恒定環(huán)境溫度下(5±1℃、15±1℃、25±1℃和35±1℃),于死后12個時間點(Oh、1h、3h、6h、12h、 24h、36h、48、72h、96h、120h和144h)分別取出心肌組織、肝臟和皮膚組織；斷頸處死6只SD大鼠用以驗證模型,放置于恒定環(huán)境溫度下(10±1℃和20±1℃),于后3個時間點(15h、45h and 95h)取出三種組織；所有組織分裝于RNAlater保護液,置于-80℃凍存、備用。選取12個常用的RNA分子指標,并設計引物,分別是ACTB、GAPDH、18S、RPS29、5S、U6、let-7a、miR-1、miR-133a、miR-206、miR-122和miR-203。3.用TRIzol法抽提人體和大鼠組織的總RNA、總RNA濃度和純度檢測和cDNA合成,并應用qRT-PCR檢測RNA指標的循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)。4.通過geNorm軟件對12個候選分子標志物進行統(tǒng)計處理,選取人體組織與動物組織相統(tǒng)一的內參指標。結果顯示：5S、U6、miR-133a和RPS29適合作為心肌組織的內參,5S、U6、RPS29和miR-122適合作為肝臟組織的內參,5S、U6、RPS29和miR-203適合作為皮膚組織的內參。第二部分5.對ACTB和GAPDH的Ct值進行內參標準化處理,建立循環(huán)閾值差值(deltaCt,△Ct)與PMI的回歸方程(一次、二次和三次方程),擇優(yōu)選擇構建數學模型。6.將已知PMI的大鼠樣本和人體樣本△Ct值帶入方程進行驗證,統(tǒng)計推測PMI的誤差率,明確環(huán)境溫度、死亡原因等因素對精確PMI推斷的影響。驗證結果表明大鼠樣本的總誤差率為14.4±2.2%,人體樣本的總誤差率為34±19%,證實運用該數學模型推斷PMI相對準確有效。7.研究發(fā)現環(huán)境溫度升高可以明顯的增加RNA的降解速率,詳細的環(huán)境溫度記錄可以有效的提高推斷PMI的精度。8.在三種組織中,肝臟組織擁有最低的誤差率,尤其適合早期PMI的推斷；而心肌組織更適合用于晚期PMI的推斷；雖然皮膚組織具有最高的誤差率,但在某些特殊案件如碎尸案有無可取代的價值。9.死亡原因也對RNA表達量具有影響,GAPDH表達量在失血性休克樣本和機械性窒息樣本中表達上調,導致推斷的PMI小于真實PMI,誤差率為負值。第三部分10.135只SD大鼠隨機分為斷頸死組、窒息死組和失血性休克死組,尸體保存于室溫(25±1℃)環(huán)境下,于死后9個時間點(Oh、3h、6h、12h、24h、36h、48h,72h和96h)提取心肌組織,分裝于RNA later保護液中,置于-80℃凍存、備用。并應用實時熒光定量PCR檢測GAPDH、ACTB、HIF-1、iNOS、TNF-α、IL-6和U6的Ct值,觀察各RNA在不同死因下隨PMI的變化情況。11.U6非常穩(wěn)定,受PMI和死因的影響較小,適合作為內參指標。在死亡早期,GAPDH、HIF-1、iNOS、TNF-α和IL-6的表達量在窒息死組和失血性休克死組比斷頸死組呈現不同程度的增加,而ACTB在三個組皆呈現表達量下降趨勢。在死亡晚期,隨著mRNA的不斷降解,各RNA指標表達量持續(xù)下降。因此,死后各RNA相對表達量隨PMI的特征性的變化可為不同死因下PMI的推斷提供參考。結論與展望本課題按照標準化的qRT-PCR技術流程,篩選出穩(wěn)定通用的內參標志物,并通過多溫度、多組織的動物模型,綜合多個分子指標構建數學模型推斷死亡時間。應用大鼠樣本和實際案例檢驗數學模型,較低的誤差率證實此方法的精確性和可靠性,同時探討環(huán)境溫度及死亡原因等因素對于死亡時間判斷的影響程度。本課題將繼續(xù)收集人體樣本(增加樣本種類、數量)進行大量的組織驗證,進一步優(yōu)化數學模型,提高人體死亡時間推斷的精確性,使之更有利于法醫(yī)實際工作的開展。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：D919

【共引文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 潘暉;呂葉輝;張恒;陳龍;;mRNA和microRNA在機械性窒息死推斷中的研究進展[J];中國法醫(yī)學雜志;2014年02期

2 馬劍龍;陳龍;;死亡時間推斷的方法學研究進展[J];中國法醫(yī)學雜志;2015年05期

中國碩士學位論文全文數據庫 前1條

1 張凌宇;大鼠骨骼肌挫傷后ASCT2 mRNA時序性表達研究[D];山西醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：1260259